一种陈皮挥发油的提取方法及其检测方法与用途

1.本发明涉及天然产物制备和应用领域，具体涉及一种陈皮挥发油的提取方法、成分分析和应用。


背景技术：

2.陈皮(pericarpium citri reticulatae)为芸香科植物橘(citrus reticulata blanco)及其栽培变种的干燥成熟的果皮，在东南亚和东亚地区，数百年来广泛用于烹饪和饮料调味品，具有理气健脾、燥湿化痰的功效，在临床上用途广泛，常用于治疗胸腹胀满、不思饮食、呕吐哕逆、咳嗽痰多。陈皮中含有挥发油、黄酮类、生物碱等化学成分。
3.挥发油常用的提取方法有水提法、微波法、酶辅助法和超临界二氧化碳法等。其中水提法是从天然植物中提取挥发油最常用的方法。其工艺、设备、操作等技术相对成熟、简单，且成本低。对相应的萃取工艺进行优化可以为工业生产提供更多的产品。陈皮的品种，储存年份和挥发油提取方法等条件都会影响陈皮挥发油的提取率。盛永成(不同杂柑皮与多种陈皮挥发油对比分析研究：世界科学技术-中医药现代化、2020,22(04):1199-1206)等收集10个品种杂柑皮和12个品种陈皮挥发油，发现挥发油的提取率从1.00％-6.67％，品种对挥发油的影响较大。郑敏燕(spme/gc/ms对比分析不同年份陈皮挥发性成分：广东化工、2011,38(03):127-128+137)研究发现随着存放时间的增加，陈皮挥发性成分的总量有所降低，挥发油成分的含量会发生变化。黄景晟(超临界co2萃取陈皮挥发油及其化学成分分析：现代食品科技、2013,29(08):1961-1966)等研究表明，超临界二氧化碳提取陈皮挥发油最佳提取工艺为萃取温度35℃，萃取压力16mpa，萃取时间120min，原料颗粒度为陈皮粉碎过30目筛，在此条件下，陈皮挥发油得率为3.96％。周国海(陈皮挥发油的低温连续相变萃取及特性分析：现代食品科技、2013,29(12):2931-2936)等优化了低温连续相变萃取法提取陈皮挥发油的工艺，结果表明最佳工艺为原料颗粒度40目，萃取时间70min，解吸温度75℃，萃取温度30℃，萃取压力0.5mpa，此工艺下挥发油得率为3.31％，形态为黄色至红棕色的半固体膏状物。周容(一种使用酶解辅助提取陈皮精油的方法，cn111471526a)等公开了一种使用酶解辅助提取陈皮精油的方法，其使用β-葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶组合成的复合酶对陈皮进行酶解，随后进行连续回流提取3h，陈皮精油得率最高为2.37％。谢捷(闪式辅助水蒸气蒸馏提取陈皮挥发油工艺的优化研究：林业实用技术、2010(10):49-51)等研究表明闪式辅助水蒸气蒸馏法提取的最佳工艺条件为闪式预处理120秒，液固比15ml/g，闪式预处理2次，水蒸气蒸馏40min，陈皮挥发油得率为2.46％。李瑞明等研究表明蒸馏水提取最佳提取工艺为浸泡1h，料液比1:8，蒸馏5h，此条件下挥发油得率为5.41％。高敏惠(正交试验法优选陈皮挥发油的提取工艺：中国社区医师、2014,30(01):7-8)通过正交实验优化水蒸馏提取，最佳提取工艺条件为蒸馏水浸泡20分钟，提取3小时，提取率为1.98％。
4.陈皮挥发油主要由萜烯组成，其中柠檬烯为主要成分，其次是α-蒎烯、γ-松油烯、β-月桂烯、β-蒎烯和芳樟醇等萜烯。萜类化合物对疾病具有保护或预防作用，对人类健康非常重要。陈皮的品种、储存年份和陈皮挥发油的提取方法都会影响陈皮挥发油的化学成分
及含量。杨元丰(《中国药典》中四个品种来源的陈皮挥发油gc-ms分析比较：井冈山大学学报(自然科学版)、2018,39(06):77-81)等对《中国药典》中4个品种来源的陈皮挥发油成分进行了gc/ms检测和主成分(pca)与聚类分析发现4个陈皮样品中的挥发油化学成分组成基本相似，但同一地区不同品种、不同地区不同品种的样品相似性均存在较大差异，含量区分明显。丘芷柔(固相微萃取优化/gc-ms法分析不同年份陈皮的挥发性成分：现代食品科技、2017,33(07):238-244)等以1978年、2000年、2013年陈皮为原料，采用顶空固相微萃取结合gc-ms的方法检测出了44种挥发性成分，随着陈皮贮藏年限的延长，挥发性物质的种类会明显增多，其中以烃类、醛酮类和酚类等物质变化最为明显。周欣(gc/ms对不同年份新会陈皮挥发油的分析：中药材、2009,32(01):24-26)等研究发现，随着年份的增长新会陈皮挥发油随着时间增长成分含量会发生变化，甚至出现一些新的成分。
5.在体外实验中，柠檬烯显示出浓度依赖性的减少自由基形成，shah(in vitro evaluation of antioxidant activity of d
–
limonene：asian j.pharm.pharmacol、2018(4):883
–
887)等人研究表明，柠檬烯对dpph、abts、-oh自由基和超氧阴离子清除率的ic
50
值分别是384.73μm、603.23μm、442.75μm和105.25μm。余祥英(陈皮挥发油组成分析及其单体的抗氧化性研究：食品与发酵工业、2021,47(09):245-252)等研究表明，新会茶枝柑和福建芦柑陈皮挥发油清除dpph、abts阳离子自由基能力的分别为31.64、15.63mg/ml和19.14、13.75mg/ml。崔佳韵(不同年份新会陈皮挥发油的抗氧化活性评价：食品科技、2019,44(01):98-102)研究表明不同年份的新会陈皮挥发油均表现出dpph、abts、羟基自由基清除能力和还原能力,且抗氧化效果与挥发油的体积分数呈量效关系。段亮亮(陈皮精油对大肠杆菌的抑菌作用研究：食品安全质量检测学报、2022,13(01):231-238)等人研究发现陈皮挥发油对大肠抑菌作用较强，最小抑菌浓度为1.28mg/ml。bei gao(chemical composition,antioxidant and antimicrobial activity of pericarpium citri reticulatae essential oil.mol.2011,16(5):4082-4096)等人研究表明陈皮挥发油的抗氧化能力随贮藏时间的延长而发生变化。此外，随着贮藏时间的延长，不同年份陈皮挥发油对同一种菌株的抑菌圈大小有所变化，陈皮挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌均有不同程度的抗菌活性。
6.咳嗽是内源性或外源性刺激物患者最常见的症状。它是一种对上呼吸道刺激的反应，是各种气道炎症疾病的重要症状，也是世界范围内的一个主要公共卫生问题，因为它可以降低舒适度并引起睡眠障碍。天然产物的活性成分由于其高效、低副作用的特点，作为预防和治疗咳嗽的潜在治疗药物越来越受到关注。陈皮在《中国药典》2020版的【功能与主治】记载为理气健脾，燥湿化痰，用于脘腹胀满，食少吐泻，咳嗽痰多，用量为3-10g，但至今未见陈皮挥发油在镇咳祛痰方面的报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种响应面法优化水提陈皮挥发油的提取工艺。该提取方法工艺简单，成本低，具有较好的抗氧化活性，且对金黄色葡萄球菌、酿酒酵母菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌具有良好的抑菌效果，且有较好的镇咳能力。
8.根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种陈皮挥发油的提取方法，包括如下
步骤：
9.步骤1，将陈皮粉碎成粉末过筛备用。
10.步骤2，将步骤1所得的陈皮粉末加入其液料比为10～30(ml/g)倍的蒸馏水，搅拌均匀浸泡5～9h后，用挥发油提取装置提取2～6h，得到陈皮挥发油。本发明选用浸泡时间、提取时间、液料比作为自变量，提取率为响应值，在单因素实验结果的基础上进行ccd响应面优化陈皮挥发油提取工艺。
11.优选的，所述陈皮挥发油的提取工艺，浸泡时间为4.2h。
12.优选的，所述陈皮挥发油的提取工艺，提取时间为7.2h。
13.优选的，所述陈皮挥发油的提取工艺，液料比为17ml/g。
14.通过本发明提供的陈皮挥发油提取工艺，提取率可以达到2.11
±
0.03％。本发明方法制备出的陈皮挥发油中通过气相色谱-质谱法测定，分析鉴定出34种成分，占总量的99.16％；单萜类成分是陈皮挥发油的主要成分，占83.61％，其次为倍半萜烯，占11.65％。所述挥发油的化学成分主要包括：柠檬烯(69.43％)、γ-松油烯(8.93％)、α-法昵烯(3.56％)、β-榄香稀(2.55％)、杜松烯(1.7％)。
15.根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种陈皮挥发油的检测方法，所述陈皮挥发油由上述提取方法提取，采用气相色谱-质谱法测定。
16.优选的，所述气相色谱-质谱法测定的具体方法为：将陈皮挥发油用甲醇稀释10倍后通过微孔膜过滤进行进样；
17.分析检测条件：rxi 5ms毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25m)，氦气为载气，流速为1ml/min，进样量为1.0μl；升温程序：初始温度60℃保持3min，以6℃/min的速度升高柱温至100℃，然后以8℃/min的速度升高柱温至280℃，保持10min；进样口温度为280℃，柱压为49.5kpa。
18.对于质谱，离子源温度为230℃；电子轰击离子源(ei)能量为70ev，扫描范围为40～500m/z，利用质谱库(nist 05)对其进行质谱鉴定。
19.根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种陈皮挥发油的用途，所述陈皮挥发油由上述提取方法提取，用于制备抗氧化、抗菌或镇咳药物中的用途。
20.优选地，所述抗氧化药物是指抗dpph和/或abts自由基的药物；本发明得到挥发油对dpph自由基清除率的ic
50
值为14.08mg/ml，对abts自由基清除率的ic
50
值为1.48mg/ml，有较好的抗氧化活性，显著优于其它现有技术。优选地，所述抗菌药物是指抗金黄色葡萄球菌、酿酒酵母菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌和白色念珠菌中的至少一种；进一步优选为抗酿酒酵母菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌和白色念珠菌，更优选为抗大肠杆菌。本发明得到的陈皮挥发油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为12.6mg/ml，对酿酒酵母菌的最低抑菌浓度为100mg/ml，对短小芽孢杆菌的最低抑菌浓度为6.25mg/ml，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为3.13mg/ml，对白色念珠菌的最低抑菌浓度为100mg/ml，有良好的抑菌效果。
21.本发明得到的陈皮挥发油，在镇咳实验中表现出很好的活性，与生理盐水组相比，陈皮挥发油的镇咳作用随浓度的增加而增加，且活性显著升高(p《0.05)。当陈皮挥发油的给药浓度达到400mg/ml时，小鼠接触25％～28％氨雾后3min内的咳嗽潜伏期(114.6
±
6.9)比阳性对照氨溴索组(112.2
±
9.8)略高，而咳嗽次数(33.6
±
2.6)和阳性对照氨溴索组(51
±
4.4)相比明显降低，有很好的镇咳作用。
附图说明
22.图1为提取时间对陈皮挥发油提取率的影响；
23.图2为浸泡时间对陈皮挥发油提取率的影响；
24.图3为料液比对陈皮挥发油提取率的影响；
25.图4为提取时间和浸泡时间对陈皮挥发油提取率影响的3d响应面图；
26.图5为提取时间和液固比对陈皮挥发油提取率影响的3d响应面图；
27.图6为浸泡时间和液固比对陈皮挥发油提取率影响的3d响应面图；
28.图7为陈皮挥发油对dpph自由基的清除率；
29.图8为陈皮挥发油对abts自由基的清除率；
30.图9为陈皮挥发油的咳嗽潜伏期效果图；
31.图10为陈皮挥发油抑制咳嗽次数的效果图。
具体实施方式
32.实施例1：确定陈皮挥发油提取的最佳单因素条件
33.研究用的陈皮为储存一年的陈皮，产自中国江西省，购自安国荣华中药有限公司(产品批号c125201212)。
34.用分析天平称取用粉碎机后过40目筛的陈皮粉末30g，称量好后放在洁净的两口径圆底烧瓶中，在瓶中按液料比加入去离子水，搅拌均匀后浸泡一定时间后用挥发油提取装置提取陈皮挥发油。陈皮挥发油提取率的计算公式如下：
35.陈皮挥发油提取率(％)＝(m/m)
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀ
式(1)
36.式中：m：挥发油含量(g)；m：陈皮粉末重量(g)。根据公式计算出陈皮挥发油提取率。
37.(1)提取时间对陈皮挥发油提取率的影响
38.准确称取过40目筛的陈皮粉末30g，固定浸泡时间5h，液料比15ml/g，考察提取时间在2～6h条件下陈皮挥发油的提取率。由图1可以看出，随着提取的增加，陈皮挥发油的提取率也随之增加，当提取时间达到4h时提取率达到最大，之后随着提取时间增加，提取率减小。确定最优的提取时间为4h。
39.(2)浸泡时间对陈皮挥发油提取率的影响
40.准确称取过40目筛的陈皮粉末30g，固定提取时间4h，液料比15ml/g，考察浸泡时间在5～9h条件下陈皮挥发油的提取率。由图2可以看出，陈皮挥发油提取率随着浸泡时间的增加而显著增加，浸泡时间达到7h时，提取率达到最高，之后随着浸泡时间增加提取率开始下降。
41.(3)料液比对陈皮挥发油提取率的影响
42.准确称取过40目筛的陈皮粉末30g，固定提取时间4h，浸泡时间7h，考察料液比在10～30ml/g条件下陈皮挥发油的提取率。由图3可以看出，陈皮挥发油提取率在料液比为1:15时，提取率达到最高，之后随着料液比增加提取率开始下降。
43.实施例2：响应面实验设计探究陈皮挥发油的最佳提取工艺
44.在单因素实验的基础上，以提取时间、浸泡时间和料液比为自变量，挥发油提取率为响应值，采用统计分析软件design-expert v 8.0.6进行响应面设计，实验设计与结果见
表1和表2。
45.表1响应面实验因素水平表
[0046][0047]
表2响应面实验方案及结果
[0048][0049][0050]
表3响应面模型方差分析
[0051][0052][0053]
利用design-expert v 8.0.6软件分析表2中的数据进行拟合回归，得到提取时间、浸泡时间、液固比三个因素对陈皮挥发油提取率的二次回归方程：
[0054]
y＝2.01+0.029x1+0.052x2+0.22x
3-0.16x1x2+0.096x1x3+0.13x2x
3-0.12x
12-0.21x
22-0.29x
32
。
[0055]
式中x1、x2、x3分别为提取时间、浸泡时间、液固比的编码值。对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。此模型的p值为0.0052＜0.05，表示模型极显著。方差分析结果显示，模型的精密度为7.288＞4表明模型具有较好的精度，表3中，决定系数r2为0.842，表明模型具有较好的可靠性，能反映响应值的变化84.1％。线性系数x3、x
22
、x
32
有显著影响，但交互项无显著影响，说明各因素之间的交互影响不显著。各条件对陈皮挥发油提取率的影响大小依次为液固比(x3)、浸泡时间(x2)、提取时间(x1)。该模型适用于陈皮挥发油提取结果的分析和预测，响应面如图4-6所示。
[0056]
由design expert 8.0.6.1得出的最佳提取条件为：提取时间4.18h，浸泡时间7.2h，液料比17.22ml/g。通过三个实验对模型的准确性进行了评估。结果表明，在此条件下，陈皮挥发油的实际产率为2.11
±
0.03％，预测产率为2.07％。实验结果与预测结果吻合较好，误差为1.93％。根据实验情况提取工艺调整为提取时间4.2h，浸泡时间7.2h，液料比17ml/g。
[0057]
实施例3：通过gc-ms鉴定陈皮挥发油化学成分
[0058]
对于采用最优工艺参数(提取时间4.2h，浸泡时间7.2h，液料比17ml/g)提取出的
陈皮挥发油，采用气相色谱-质谱(gc-ms)研究了陈皮挥发油的化学组成和相对含量。将陈皮挥发油用甲醇稀释10倍后通过微孔膜过滤进行进样。分析检测条件：rxi 5ms毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25m)，氦气为载气，流速为1ml/min，进样量为1.0μl。升温程序：初始温度60℃保持3min，以6℃/min的速度升高柱温至100℃，然后以8℃/min的速度升高柱温至280℃，保持10min。进样口温度为280℃，柱压为49.5kpa。对于质谱，离子源温度为230℃。电子轰击离子源(ei)能量为70ev，扫描范围为40～500m/z。利用质谱库(nist 05)对其进行质谱鉴定。根据gc的峰面积计算各组分的相对含量(％)。
[0059]
通过gc-ms分析鉴定出34成分，占总成分的99.16％。从表4-a可以看出，陈皮挥发油挥发性成分主要有柠檬烯(69.43％)、γ-松油烯(8.93％)、α-法尼烯(3.56％)、月桂烯(3.21％)、β-榄香稀(2.55％)、δ-杜松烯(1.7％)、α-毕橙茄油烯。可以看出，陈皮挥发油主要由单萜烯(83.61％)和倍半萜烯(11.65％)组成。
[0060]
表4-a陈皮挥发油的化学成分
[0061]
[0062]
[0063][0064]
注：其他是指陈皮挥发油中萜烯类化合物以外的其他成分。
[0065]
实施例4：陈皮挥发油抗氧化活性分析
[0066]
清除dpph自由基活性测定
[0067]
将陈皮挥发油(制备方法同实施例3)用无水乙醇配置成不同浓度的陈皮挥发油样品待测液，同时制备0.1mmol/l dpph
·
乙醇溶液(无水乙醇配制)；取2mldpph
·
乙醇溶液与2ml样品混合均匀在暗处放置30min后于517nm波长下测吸光值a1；无水乙醇溶液作为空白组调零；以2ml样品溶液加上2ml无水乙醇作为空白对照组，于517nm波长下测吸光值a2；以2mldpph
·
乙醇溶液加上2ml无水乙醇作为模型对照组，于517nm波长下测吸光值a0，以维生素c为阳性对照。每个试样作三次平行实验，取其平均值，根据式(1)计算样品对dpph自由基的清除率。实验结果如图7所示。
[0068]
dpph自由基清除率(％)＝((1-(a1-a2))/a0)
×
100％
ꢀꢀꢀꢀ
式(2)
[0069]
清除abts自由基活性测定
[0070]
将88μl140mmol/l过硫酸钾加入5ml7mmol/l abts中混匀，室温避光反应12h，得到abts+溶液。用乙醇稀释abts溶液，使其在734nm处吸光度为0.700
±
0.005。取2ml样品待测溶液与2ml abts溶液混匀震荡30秒，避光反应6min，在734nm处测定吸光值as，以无水乙醇代替样品，测定溶液的的吸光值a0。以维生素c为阳性对照，每个试样作三次平行实验，取其平均值，根据式(2)计算样品对自由基的清除率。实验结果如图8所示。
[0071]
abts自由基清除率(％)＝((a0-as)/a0)
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀ
式(3)
[0072]
通过清除dpph和abts自由基实验结果可知，挥发油陈皮对dpph和abts自由基的清除活性呈剂量依赖性，阳性对照维生素c对dpph、abts的ic
50
值分别为0.039mg/ml和0.006mg/ml；挥发油对dpph、abts的ic
50
值分别为14.08mg/ml和1.48mg/ml，具有一定的抗氧化能力。
[0073]
实施例5：陈皮挥发油抑菌活性分析
[0074]
通过检测陈皮挥发油(制备方法同实施例3)的最低抑菌浓度测定陈皮挥发油的抑菌活性，所用的菌珠包括金黄色葡萄球菌、酿酒酵母菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌。在96孔板中，每孔加入180μl细菌标准悬液(108cfu/ml)和20μl20％陈皮挥发油-dmso溶液(v/v)。在第一个孔中，陈皮挥发油的浓度为100mg/ml。后续10个孔通过连续稀释2倍的方法降低了eos的浓度。阳性对照为氯霉素，阴性对照为不含陈皮挥发油的20％dmso溶液。所有检测重复进行3次。实验结果见表5。
[0075]
表5陈皮挥发油的最低抑菌浓度
[0076]
[0077]
结果表明，陈皮挥发油有很好的抑菌效果，尤其是对大肠杆菌、短小芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果很好，有潜力成为一种天然抗菌剂。有报道称，以α-蒎烯、月桂烯和柠檬烯为主要成分的挥发油对革兰氏阳性菌具有良好的抑菌作用。柠檬烯可以破坏细胞膜，增加细胞膜的通透性，导致金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的细胞壁完整性被破坏，细胞死亡。陈皮挥发油有较好的抑菌活性可能是由于其富含这些活性成分。
[0078]
本发明制备的特定陈皮挥发油，对于多种菌均具有优异的抑菌效果，尤其是对于大肠杆菌，最低抑菌浓度达到3.13mg/ml；另外，本发明制备的特定陈皮挥发油对于酿酒酵母菌、短小芽孢杆菌和白色念珠菌也具有抑菌效果。
[0079]
实施例6：陈皮挥发油镇咳活性分析
[0080]
将50只雄性昆明小鼠(18-22g)随机分为5组，每组10只，剂量不同的陈皮挥发油3组，阳性对照组和阴性对照组。陈皮挥发油组为用2％(v/v)吐温80溶解的高、中、低剂量的陈皮挥发油悬浮液，给药剂量分别为400、200、100mg/kg。阳性对照组为可可碱，给药剂量为50mg/kg，空白对照组为生理盐水。根据小鼠体重，灌胃量为0.2ml/10g。实验前及末次给药前，各组小鼠禁食不禁水12h。连续给药7天。最后一次给药1小时后，逐一将小鼠放入多功能诱咳引喘机向内喷入25％～28％氨水气雾7秒对小鼠进行引咳,立即使用秒表计时,记录小鼠的咳嗽潜伏期和3min内咳嗽次数。小鼠咳嗽行为的判断是以张大嘴腹肌收缩为佳,可听到轻微咳嗽声；潜伏期是开始喷雾到产生咳嗽的时间。实验结果见表6，陈皮挥发油制备方法同实施例3。
[0081]
表6陈皮挥发油的镇咳活性
[0082][0083]
数值为平均值
±
sd，于阳性对照组比较，ap《0.05,于生理盐水组比较，bp《0.05。
[0084]
从表6可以看出，和阴性对照组相比，各给药组的相比生理盐水组，镇咳活性明显增加。陈皮挥发油的镇咳能力与给药剂量呈剂量依赖性，给药剂量越高，镇咳能力越好。当给药剂量达到400mg/kg时，陈皮挥发油组的咳嗽潜伏期(146
±
6.9秒)比阳性对照组(112.2
±
9.8秒)略高，而咳嗽次数(33.6
±
2.6次)明显比阳性对照组(51
±
4.4次)少，说明陈皮挥发油有很好的镇咳作用。
[0085]
上述实施例为本发明优选地实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。