CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法

本发明属于病毒检验检测，涉及一种crispr/cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒h1n1可视化检测的方法。

背景技术：

1、流感病毒是一种包膜、分段、负链、单链rna病毒。大多数温血动物都可以成为流感病毒的宿主，历史上曾引起许多大流行，在世界范围内有相当高的发病率和死亡率。目前，流感病毒包括a、b、c、d型。甲型流感病毒是最严重和最致命的病毒。在一年内，这种病毒传播到214个国家，造成全球超过18000人死亡，并已成为一个主要的国际公共卫生问题。

2、病毒的分离和培养是诊断流感病毒的金标准。但目前由于逆转录酶聚合酶链反应(rt-pcr)的优越的分析性和敏感性，其取代病毒分离培养成为新一代的金标准。同时，几种传统的检测方法被广泛应用于流感病毒的检测，包括elisa和蛋白质鉴定。随着时间的推移，流感病毒的传统检测技术有所改进。然而，该方法也有一些固有的缺点。它的操作很复杂，需要经过专业训练的人员或复杂的实验室仪器。因此，该技术不适用于常规医疗保健和资源贫乏地区。已经发展了许多检测流感病毒的新方法，包括电化学免疫传感器，表面增强拉曼散射成像适应传感器平台，荧光，比色和微流控芯片方法。其中，比色法是一种快速、方便的选择，不需要先进的仪器。

3、有规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)是大多数古细菌(约87％)和细菌(约47％)源于防御病毒dna或rna的需要，已经进化出的一个免疫反应系统。完整的crispr基因组中包含一系列crispr阵列、crispr相关(cas)蛋白基因和由不同间隔区隔开的直接重复序列。随着病毒的出现，crispr-cas位点会触发“适应-表达-干扰”的三阶段免疫反应，破坏宿主细胞内的噬菌体入侵。目前crispr/cas9研究得最为清楚，其防御过程主要为三阶段：crispr捕获序列间隔序列、合成成熟的crispr rna、靶标干扰后定向切割。crispr/cas13a(c2c2)是张锋小组在2016年首次描述了一种靶向rna的crispr相关酶，与ii类中的其他cas蛋白相比，cas13a对单链rna(ssrna)具有顺式和反式切割活性，cas13a能够切割和修剪pre-crrna以产生成熟的crrna。crispr/cas系统因识别精确性，高效性和简便性等优点，目前已广泛应用于农业、生物、化学等各种领域。

4、为了进一步提高分析性能，cas13a系统已与多种信号扩增技术相结合，如滚动环扩增(rca)、重组酶聚合酶扩增(rpa)和环介导等温扩增(lamp)，其中一些等温核酸扩增技术采用昂贵的酶，有些由于需要逆转录，操作繁琐，杂交链反应(hcr)是由dirks和pierce介导的链置换反应，hcr是一种无酶、熵驱动、等温的自发dna组装过程。一个普通的hcr需要三个成分，包括一个dna启动子和两个dna发夹，特别是两个稳定的dna发夹在溶液中共存，直到一个启动子链被引入后第一个发夹被打开。二级结构的丢失导致了第二个类似的发夹的打开。这个过程是一系列的dna组装事件。最终，hcr形成了一个具有许多重复单元的缺口双螺旋结构。与pcr相比，hcr用于等温核酸扩增，不需要繁琐的温度变化。与rca和lamp相比，hcr不需要酶和复杂的引物设计。

5、辣根过氧化物酶模拟dnazyme(hrp-dnazyme)来结合cas13a和hcr。hrp-dnazyme是生物传感器和生物识别技术中最常用的催化dnazymes之一。单链富含鸟嘌呤的核酸和血红素复合物成分相互作用，催化过氧化氢(h2o2)和2,2‘-叠氮-双(3-乙基-苯并噻唑啉)-6-磺酸(abts2-)之间的氧化还原反应，并伴随颜色变化。这种方法不需要繁琐的仪器和昂贵的改良探针(如荧光团、猝灭剂、亚甲基蓝等)。以实现分析物识别事件的转导到一个光学检测模式。该比色生物传感器放大信号，降低实验条件，以达到视觉检测流感h1n1的目的。我们观察到比色生物传感器在10pm到100nm之间存在良好的线性关系，检测限为0.152pm。由于cas13a具有突出的选择性，因此在扩增反应中可以排除其它靶标外的甲型流感病毒亚型。本文提供的数据表明，这种基于cas13a的比色生物传感器是一种很有前途的生物分析的分析方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种crispr/cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒h1n1可视化检测的方法，该方法不需要改变温度环境，快速高效，对病毒的生物学检测具有重要的应用价值。

2、本发明的crispr/cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒h1n1可视化检测的方法，步骤如下：

3、通过比色生物传感器识别h1n1，并通过crispr/cas13a蛋白系统保证反应的特异性。从h1n1流感病毒中提取的靶rna进入crispr/cas13a蛋白内部后，通过碱基互补配对与crrna结合。这改变了蛋白质的结构，并激活了crispr/cas13a蛋白的反式切割能力。设计了一个含有三个尿苷单磷酸的dna核苷酸链(探针i)。该探针被设计为cas13a/crrna反式裂解的底物。dna探针i由5′端的i1链、中间的一个特殊的rna序列(-uuu-)和3′端的i2链组成。用生物素修饰i1链，使该链能够启动hcr反应。该特殊的rna序列(-uuu-)被crispr/cas13a系统识别和切割。cas13a被激活并裂解探针i的rna序列，探针i分离成i1和i2链。加入sa-mbs，生物素与sa相互作用。含有生物素的未裂解探针i和i1链被sa-mbs吸附，然后通过磁分离将其从溶液中去除。加入发夹h1和h2后，i2链与h1结合，通过趾点介导的链置换打开h1发夹。i2-h1复合物的杂交打开了h2的发夹结构。打开的h2链与发夹h1链互补，导致h1链的发夹结构打开，从而引发hcr反应。由于h1和h2发夹结构不断地打开和组装，h1的g-四联体片段暴露出来。

4、随后，在血红素的存在下，g-四联体结构折叠，血红素插入到该结构中，形成一个dnazyme。g-四联体dnazyme可以催化abts2-和h2o2之间的氧化还原反应。abts溶液的颜色由浅绿色变成深绿色。由此开始的比色反应，产生肉眼可见的反应溶液的颜色变化，形成超灵敏的h1n1流感病毒视觉检测。

5、进一步特征，分别对crispr/cas13a蛋白浓度、crispr/cas13a酶切温度、crispr/cas13a酶切时间、探针i浓度、hcr反应时间以及hemin浓度进行了优化。

6、进一步特征，crispr/cas13a蛋白浓度：选择0.2、0.4、0.6、0.8及1.0μm的cas13a蛋白，按照具体步骤进行优化。分析如图2-4a，随着cas13a蛋白加入量的增加，比色度变化强度(i/i0)也随之增加，当cas13a蛋白浓度达到0.8μm时，i/i0值的变化强度逐渐趋于稳定。所以选择0.8μm作为最佳crispr/cas13a蛋白浓度加入量，不但能达到最佳实验条件，同时可以降低成本。

7、进一步特征，crispr/cas13a酶切温度：选择25℃、37℃、45℃、55℃及65℃进行优化，如图2-4b可以分析出，随着crispr/cas13a酶切温度的增加i/i0的值是先增加后减小，当酶切温度达到37℃时比色度变化强度的值达到最大，由此可知，crispr/cas13a酶切温度过低或着过高，对比色度变化强度都有影响，都不利于crispr/cas13a蛋白发挥最佳活性。所以选择37℃作为最佳酶切温度。

8、进一步特征，探针i浓度：选择了0.25、0.75、1.25、1.75、2.25及2.75μm作为探针i浓度，分别对应i：h1：h2为0.1(0.3，0.5，0.7，0.9，1.1):2:1.5，按照上述实验步骤进行优化。如图2c可以得出，比色度变化强度随着探针i加入量的不断增加，呈现先增大后减小的趋势，当探针i浓度高于1.25μm后，比色度变化强度的值增加平缓，可忽略不计，从成本上考虑选择1.25μm作为最佳引物探针i加入量。

9、进一步特征，hemin浓度：选择5、10、15、20、25及30μm的hemin浓度，按照具体步骤进行优化。分析如图2d，随着hemin浓度加入量的增加，比色度变化强度也随之增加，当hemin浓度超过10μm达到时15μm，比色度变化强度有很大程度的下降。所以选择10μm作为最佳hemin加入量，此条件下能达到最佳实验结果。

10、进一步特征，crispr/cas13a酶切时间：在酶切时间分别为10、20、30、40、50及60min的情况下，按照上述实验步骤进行优化，分析如图2e可以得出，比色度变化强度随着酶切时间的变化而变化，当酶切时间达到30min时，随着时间的增加，i/i0的值增加平缓且有少许的降低。从时间上考虑选择30min作为最佳酶切时间。

11、进一步特征，hcr反应时间：选择了10、20、30、40及50min作为hcr反应时间，进行实验条件的优化，分析如图2f可以看出，i/i0值随着hcr反应时间的增加而增加，当hcr反应时间达到40min时，i/i0值的增加逐渐趋于平缓。所以选择40min作最佳hcr反应时间。

12、本发明的有益效果是：

13、一种基于crispr/cas13a的h1n1流感病毒无标记等温检测方法，设计一条寡核苷酸探针i链作为cas13a/crrna的反式裂解底物，并作为裂解后的hcr的引物。该方法采用了双信号放大策略，可以大大提高灵敏度。该检测方法对h1n1流感病毒的检测限为0.152pm，在10pm～100nm之间线性度良好。该检测方法也有很好的特异性。其他甲型流感病毒和只有一个碱基差异的高度同源rna探针可以清楚地区分。