一种聚乙二醇修饰的IL-21衍生物及其应用的制作方法

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的il-21衍生物及其应用。

背景技术：

1、白细胞介素-21(interleukin-21，il-21)属于il-2家族的成员，是一个多功能性的细胞因子，对淋巴细胞和骨髓细胞具有多种生物学效应，在自然免疫和获得性免疫中都发挥重要的作用。il-21主要由活化的cd4+t细胞、nk细胞、tfh细胞、th17细胞分泌，能提高免疫细胞的抗原特异性反应。il-21对t细胞的作用是多效应的，包括促进细胞增殖和增强细胞毒性。il-21可以诱导cd8+t细胞和nk细胞增殖和成熟并增强其细胞毒性，从而增强机体免疫反应。il-21通过调节b细胞的增殖，分化成浆细胞来进行免疫应答1。il-21还可以促进记忆cd8+t细胞分化和抑制treg细胞2。

2、人源的il-21含有134个氨基酸，结构上形成了四个α螺旋束。il-21中有四个半胱氨酸残基(c42,c49,c93和c96)，其中第42位和93位的半胱氨酸形成二硫键，第49位和96位的半胱氨酸形成二硫键3。

3、il-21受体是一个由il-21独有的亚单位il-21r和γ链组成的异二聚体，其中il-21r为配体识别结合部位，γ链为信号转导单位。il-21r在t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞和单核/巨噬细胞的表面广泛表达。il-21与il-21r具有很高的亲和力，高达70pm。il-21与其异二聚体受体结合后，主要通过蛋白酪氨酸激酶jak/信号转导和转录激动子sata通路进行信号传导，活化jak(jak1和jak3)，随后磷酸化stat1、stat3、stat4和stat5，最后进入细胞核内调节相应基因的表达4。γ受体为il-2,il-4,il-7,il-9,il-15和il-21的通用受体。虽然il-21与γ受体的亲和力较低(160μm)，但是il-21与γ受体的相互作用却是信号转导所必须的5。

4、自上世纪八十年代以来，利用白细胞介素类蛋白，特别是il-2治疗癌症被广泛应用于临床，利用高剂量的il-2治疗黑色素瘤和肾细胞癌的效果良好6,7。但是高剂量的il-2会引起较强的副作用，比如血管渗漏综合征(vls)，导致人体器官的内积水，如肺水肿和肝细胞损伤。近年来的研究发现低剂量的il-2能诱导调节性t细胞treg，抑制免疫反应，促进肿瘤逃逸8。因此低剂量的il-2不能被用于治疗肿瘤，il-2在临床上的应用前景被剂量和毒副问题大大限制。il-21作为一个新兴的抗肿瘤效应的细胞因子因其明显低于il-2的毒性越来越引起人们的关注。同时低剂量的il-21并不会诱导调节性t细胞treg，仍然保持对免疫细胞的激活作用。重组人il-21在黑色素瘤和肾细胞癌的临床实验中同样展现出了良好的抗肿瘤效果9。在结肠癌和乳腺癌小鼠模型中，低剂量的il-21便能诱导出良好的抗肿瘤效应10,11。虽然il-21对机体的毒副作用较低，但临床实验表明人il-21的最大耐受剂量是30μg/kg。随着il-21用药量的增加，毒副作用便开始出现。il-21最常见的不良反应包括头痛、疲劳、发热、恶心、肌痛/关节痛、皮疹、腹泻、血小板减少等12,13。

5、il-21较短的半衰期和较差的稳定性也大大限制了il-21的作为抗肿瘤药物的开发8。野生型il-21的血浆半衰期较短，在小鼠中仅0.2小时，在食蟹猴中是0.4-0.8小时，在人体内约为2小时10。因此，设计一种可靠的长效且稳定的il-21对抗肿瘤药物的开发具有重要意义。

6、1.spolski,r.&leonard,w.j.interleukin-21:a double-edged sword withtherapeutic potential.nat.rev.drug discov.13,379–395(2014).

7、2.deng,s.et al.targeting tumors with il-21reshapes the tumormicroenvironment by proliferating pd-1inttim-3-cd8+t cells.jci insight 5,132000(2020).

8、3.hamming,o.j.et al.crystal structure of interleukin-21receptor(il-21r)bound to il-21reveals that sugar chain interacting with wsxws motif isintegral part of il-21r.j.biol.chem.287,9454–9460(2012).

9、4.davis,m.r.,zhu,z.,hansen,d.m.,bai,q.&fang,y.the role of il-21inimmunity and cancer.cancer lett.358,107–114(2015).

10、5.zhang,j.-l.,foster,d.&sebald,w.human il-21and il-4bind to partiallyoverlapping epitopes of common gamma-chain.biochem.biophys.res.commun.300,291–296(2003).

11、6.atkins,m.b.et al.high-dose recombinant interleukin 2therapy forpatients with metastatic melanoma:analysis of 270patients treated between1985and 1993.j.clin.oncol.off.j.am.soc.clin.oncol.17,2105–2116(1999).

12、7.fyfe,g.et al.results of treatment of 255patients with metastaticrenal cell carcinoma who received high-dose recombinant interleukin-2therapy.j.clin.oncol.off.j.am.soc.clin.oncol.13,688–696(1995).

13、8.berraondo,p.et al.cytokines in clinical cancerimmunotherapy.br.j.cancer 120,6–15(2019).

14、9.thompson,j.a.et al.phase i study of recombinant interleukin-21inpatients with metastatic melanoma and renal cell carcinoma.j.clin.oncol.off.j.am.soc.clin.oncol.26,2034–2039(2008).

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16、11.liu,h.et al.an engineered il-21with half-life extension enhancesanti-tumor immunity as a monotherapy or in combination with pd-1or tigit blockade.int.immunopharmacol.101,108307(2021).

17、12.davis,i.d.et al.an open-label,two-arm,phase i trial of recombinanthuman interleukin-21in patients with metastatic melanoma.clin.cancerres.off.j.am.assoc.cancer res.13,3630–3636(2007).

18、13.schmidt,h.et al.safety and clinical effect of subcutaneous humaninterleukin-21in patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma:aphase i trial.clin.cancer res.off.j.am.assoc.cancer res.16,5312–5319(2010).

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的现状及存在的不足，通过对il-21的结构进行分析，在不影响il-21整体结构的情况下，将il-21中特定的位点突变成半胱氨酸，再通过巯基偶联将合适的peg分子连接到il-21上突变后的半胱氨酸上。peg修饰后的il-21血浆半衰期延长，具有优异的剂量依赖的抗肿瘤药效。此外，peg修饰的il-21具有更好的水溶性，有利于药物的制剂配方。相较于其他长效化的il-21融合蛋白需要在哺乳动物细胞中表达，本发明中peg修饰运用的il-21骨架蛋白是在大肠杆菌中表达并通过变复性纯化得到的，具有低成本，高产率的产业化优势。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案施行：

3、在第一方面，本发明提供一种il-21突变体，所述il-21突变体选自如下任一种：

4、(a)其氨基酸序列由seq id no:1所示序列突变而来，在选自下组的一个氨基酸残基位点突变为半胱氨酸c：n25，k52，k56，n59，g61，n82，s98；

5、或，

6、(b)所述il-21突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的n25，k52，k56，n59，g61，n82，s98位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；

7、或，

8、(c)所述il-21突变体由在(a)所述的氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述il-21突变体的功能，其中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的n25，k52，k56，n59，g61，n82，s98位与(a)所述的氨基酸序列中的相同。

9、在优选的实施方式中，所述il-21突变体(a)其氨基酸序列由seq id no:1所示序列突变而来，在选自下组的一个氨基酸残基位点突变为半胱氨酸c：n25，k56，n59，g61，n82，s98。

10、在优选的实施方式中，所述il-21突变体(a)其氨基酸序列由seq id no:1所示序列突变而来，在选自下组的一个氨基酸残基位点突变为半胱氨酸c：n59，g61，n82，s98。

11、在优选的实施方式中，所述il-21突变体(a)其氨基酸序列由seq id no:1所示序列突变而来，在选自下组的一个氨基酸残基位点突变为半胱氨酸c：n59，n82，s98。

12、在第二方面，本发明提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明第一方面所述的il-21突变体。

13、在第三方面，本发明提供一种表达载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核苷酸序列。

14、在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的表达载体或者其基因组中整合有本发明第二方面所述的核苷酸序列。

15、在优选的实施方式中，所述宿主细胞是细菌；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)；最优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)。

16、在第五方面，本发明提供一种第一方面所述的il-21突变体的聚乙二醇衍生物，所述聚乙二醇修饰剂连接于il-21突变体突变位点的半胱氨酸上。

17、在优选的实施方式中，所述的聚乙二醇修饰剂为巯基聚乙二醇修饰剂，是具有选自乙烯砜、马来酰亚胺或碘乙酰胺的官能团的多元醇衍生物。

18、在优选的实施方式中，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量为20kda。

19、在第六方面，本发明提供一种制备第五方面所述il-21突变体的聚乙二醇衍生物的方法，包括如下步骤：用硫醇反应性多元醇剂和第一方面所述的il-21突变体反应，所述il-21突变体具有单一游离的半胱氨酸残基，所述多元醇试剂和所述il-21突变体的单一游离的半胱氨酸残基特异性共价结合，形成共价硫醚键，得到多元醇-il-21突变体偶联物，回收纯化产生的目的多元醇-il-21突变体偶联物，即得。

20、在优选的实施方式中，其中所述il-21突变体的聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分具有10～40kda之间的分子量。

21、进一步优选地，所述il-21突变体的聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分具有20kda的分子量。在本发明中，计算il-21突变体聚乙二醇衍生物的浓度和质量时并未将聚乙二醇的分子量包含在内，仅计算了il-21突变体蛋白的分子量。

22、在第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的il-21突变体，或第五方面所述il-21突变体的聚乙二醇衍生物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

23、在第八方面，本发明提供第一方面所述的il-21突变体、或第五方面所述il-21突变体的聚乙二醇衍生物，或第七方面所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述的药物是调节或激活免疫的药物或抗肿瘤药物。

24、在第九方面，本发明提供第一方面所述的il-21突变体、或第五方面所述il-21突变体的聚乙二醇衍生物，或第七方面所述的药物组合物在制备促进b细胞分化增殖，促进t细胞分化增殖，促进nk细胞分化增殖的制剂中的应用。

25、在第十方面，本发明提供第一方面所述的il-21突变体、或第五方面所述il-21突变体的聚乙二醇衍生物，或第七方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的用途。

26、本文中所有的氨基酸序列编号均以天然il-21(seq id no:1)序列为准，第一个氨基酸编号为1，依次类推。由于本发明中所有蛋白均使用大肠杆菌表达，所以本发明中所有蛋白均在-1位含有起始氨基酸甲硫氨酸，其不影响il-21活性，其中仅在天然il-21的-1位添加起始氨基酸甲硫氨酸的il-21在本文中定义为野生型il-21(wt-il-21)。

27、本发明的有益效果：

28、1、本发明通过对il-21的结构进行分析，成功找到了七个位点并突变成半胱氨酸。这七个位点远离il-21与il-21r的相互作用界面，突变后并不会显著改变il-21的结构，也不会影响il-21与il-21r的相互作用。进一步通过化学偶联在点突变引入的半胱氨酸上进行peg修饰。peg修饰后的il-21突变体随着分子量的增大降低了肾小球透过率，从而延长了血浆半衰期。另一方面，peg分子会阻碍蛋白酶靠近il-21突变体，防止il-21突变体被蛋白酶水解从而延长il-21的血浆半衰期。

29、2、peg修饰的il-21突变体具有更好的水溶性，有利于药物的制剂配方。

30、3、相较于其他长效化的il-21融合蛋白需要在哺乳动物细胞中表达，本发明中peg修饰运用的il-21突变体骨架蛋白是在大肠杆菌中表达并通过变复性纯化得到的，具有低成本，高产率的产业化优势。

31、4、peg修饰后的il-21突变体分子药效温和，保持了低毒性的特征，在高达18mg/kg的给药剂量下仍然没有表现出明显的毒副作用，具有很高的用药安全性。

32、5、小鼠肿瘤模型的药效实验表明peg修饰后的长效化il-21突变体具有优异的剂量依赖的抗肿瘤药效，相比之下野生型il-21并未明显抑制小鼠体内肿瘤生长。