一种重组Siglec15-mFc蛋白及其在甲状腺癌细胞迁移中的应用

本发明属生物，具体涉及人siglec15蛋白在甲状腺癌中的功能及相关机制探究。

背景技术：

1、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族(sialic acid-binding ig-like lectins,siglecs)能够结合糖蛋白的唾液酸化结构，介导细胞之间或细胞与病原体之间的相互作用，在免疫反应过程中发挥重要作用。siglecs家族成员主要在髓系细胞以及免疫细胞上表达。根据序列同源性，可将siglecs家族分为两类：第一类包括和cd33相关的siglecs，包括siglec3,5,6,7,8,9,10,11；另一类为结构保守的siglecs，包括siglec1,2,4,15。siglecs家族属于i型凝集素，具有一个v-set免疫球蛋白(ig)结构域，在其细胞外区域包含唾液酸结合位点和一个或多个c2-set ig结构域。siglecs家族成员通过激活和抑制受体，向基于免疫受体酪氨酸的抑制基序/免疫受体酪氨酸的激活基序(itim/itam)传递信号，参与调控免疫细胞活化、增殖和凋亡，此外，siglecs家族还能参与调控炎症反应、免疫疾病以及肿瘤的发生发展。

2、siglec15在甲状腺癌、肝癌、乳腺浸润癌、头颈鳞状细胞癌、胆管癌、胃癌以及子宫内膜癌等多种肿瘤组织中都呈现出特异性高表达的特征，且主要在肿瘤相关巨噬细胞上表达，而在肿瘤细胞中呈低表达或不表达。siglec15在膜远端igv结构域中含有保守的精氨酸(r143)基序，这对于唾液酸结合至关重要。siglec15优先识别肿瘤唾液酸-tn抗原，并向细胞内传递信号，从而促进转化生长因子tgf-β的分泌并导致巨噬细胞向m2样巨噬细胞方向极化，促进肿瘤发展；siglec15也能通过nfκb(nfat)信号转导抑制t细胞增殖并抵抗免疫反应。此外，siglec15与pd-l1表达互斥，抗体阻断siglec15或是基因消融siglec15均能增强抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长，以上表明siglec15有可能成为癌症免疫治疗中的一个新靶点。

技术实现思路

1、甲状腺癌(thyroid carcinoma，thca)是一种十分常见的内分泌系统恶性肿瘤以及头颈部恶性肿瘤，早期具有较高转移率，且近年来复发率逐步升高。目前还未查询到关于siglec15在甲状腺癌中的功能研究，因此本发明旨在提供一种重组的人源siglec15融合蛋白，明确其在甲状腺癌中的生物学功能及相应的分子机制。

2、本发明的第一方面提供一种重组siglec15-mfc蛋白，所述重组siglec1-mfc 5蛋白由siglec15胞外区第20位到第263位氨基酸片段与鼠源igg1的fc片段组成，所述siglec15胞外区第20位到第263位氨基酸片段的氨基酸序列如seq no.2所示，所述fc片段的氨基酸序列如seq no.4所示。

3、本发明的第二方面提供一种编码本发明第一方面所述重组siglec15-mfc蛋白的核苷酸分子。优选地，所述重组siglec15-mfc蛋白的siglec15胞外区第20位到第263位氨基酸片段的编码核苷酸序列如seq no.1所示，fc片段的核苷酸序列如seq no.3所示。

4、本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明第二方面所述核苷酸分子。

5、本发明第四方面提供一种重组载体，所述重组载体含有如本发明第三方面所述的核酸构建物。

6、本发明第五方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的核酸构建物或本发明第四方面所述的重组载体。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7、本发明第六方面提供一种如本发明第一方面所述的重组siglec15-mfc蛋白的生产方法，培养如本发明第五方面所述宿主细胞，从培养体系中分离纯化所述重组siglec15-mfc蛋白。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。优选地，所述培养方法包括如下步骤：①本发明第五方面所述宿主细胞单克隆加到含有抗生素的lb液培养基中，37℃，220rpm过夜摇菌(12-16h)，扩大培养；②取菌液以1:100加入到50ml 2yt液体培养基中(加入抗生素)，37℃，220rpm摇至菌液od600＝0.6；③向培养基中加入1mm iptg，30℃，180rpm诱导培养5h。优选地，所述分离纯化的方法包括如下步骤：①将培养所得的全部菌液转移到50ml离心管中，4℃，8000rpm离心15min，弃去培养液上清，收集细菌沉淀；②向沉淀中加入5ml预冷的裂解缓冲液，重悬菌体，可加入10mm咪唑，随后在冰上进行超声破碎；③所述重组siglec15-mfc以包涵体的形式表达，向包涵体中加入5ml 8m尿素溶液，重悬包涵体，室温摇床震荡至包涵体溶解8000rpm离心15min，留上清，即为变性后的蛋白溶液；④变性后的蛋白溶液通过ni柱进行纯化；⑤纯化后的蛋白溶液转移到透析袋中，依次放入到4m尿素、2m尿素、1m尿素、0m尿素的复性缓冲液中(需要预冷)，进行梯度复性，获得所述重组siglec15-mfc蛋白。

8、本发明第七方面提供如本发明第一方面所述的重组siglec15-mfc蛋白在促进甲状腺癌细胞迁移的应用。

9、本发明第八方面一种抑制甲状腺癌细胞迁移的组合物，所述组合物含有如本发明第一方面所述的重组siglec15-mfc蛋白和egfr抑制剂。优选地，所述egfr抑制剂为小分子ag1478。

10、本发明第九方面提供一种蛋白，所述蛋白能够与本发明第一方面所述的重组siglec15-mfc蛋白结合，并促进甲状腺癌细胞的迁移。

11、在一些实施方案中，siglec15-mfc能够促进甲状腺癌细胞的迁移，但是对甲状腺癌细胞的增殖和凋亡能力没有影响。在一些实施方案中，siglec15-mfc通过唾液酸结构依赖方式与甲状腺癌细胞表面的egfr相结合。在一些实施方案中，当egfr表达被抑制后，siglec15-mfc失去了促进甲状腺癌细胞迁移的能力。

技术特征：

1.一种重组siglec15-mfc蛋白，其特征在于，所述重组siglec1-mfc 5蛋白由siglec15胞外区第20位到第263位氨基酸片段与鼠源igg1的fc片段组成，所述siglec15胞外区第20位到第263位氨基酸片段的氨基酸序列如seq no.2所示，所述fc片段氨基酸序列如seqno.4所示。

2.编码如权利要求1所述重组siglec15-mfc蛋白的核苷酸分子。

3.如权利要求2所述的核苷酸分子，其特征在于，所述重组siglec1-mfc 5蛋白由siglec15胞外区第20位到第263位氨基酸片段与鼠源igg1的fc片段组成，所述siglec15胞外区第20位到第263位氨基酸片段的编码核苷酸序列如seq no.1所示，所述fc片段的编码核苷酸序列如seq no.3所示。

4.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有如权利要求2或权利要求3任一所述的核苷酸分子。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有如权利要求4所述的核酸构建物。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的核酸构建物或权利要求5所述的重组载体。

7.一种如权利要求1所述的重组siglec15-mfc蛋白的生产方法，其特征在于，培养如权利要求6所述的宿主细胞，从培养体系中分离纯化所述重组siglec15-mfc蛋白。

8.如权利要求1所述的重组siglec15-mfc蛋白在促进甲状腺癌细胞迁移的应用。

9.一种抑制甲状腺癌细胞迁移的组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的重组siglec15-mfc蛋白和egfr抑制剂。

10.一种蛋白，其特征在于，能够与权利要求1所述的重组siglec15-mfc蛋白结合，并促进甲状腺癌细胞的迁移。

技术总结
本发明属生物技术领域，涉及一种重组Siglec15‑mFc蛋白及其在甲状腺癌细胞迁移中的应用。本发明利用原核表达系统得到了含有人Siglec15胞外区的mFc融合蛋白Siglec15‑mFc，通过外源添加Siglec15‑mFc处理甲状腺癌细胞，以此探究Siglec15与甲状腺癌细胞之间的相互作用。本发明通过一系列体外实验证明了Siglec15能够通过与甲状腺癌细胞表面的EGFR相结合并增强其稳定性，进而促进甲状腺癌细胞的迁移。

技术研发人员：江建海,魏湲颜,吉致,陈启航,黄思敬,吴冰蕊
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5