一种BRAF单克隆抗体以及脂肪间充质干细胞在皮肤疾病治疗中的应用的制作方法

本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种braf单克隆抗体以及该抗体和脂肪间充质干细胞对皮肤疾病的治疗。

背景技术：

1、恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，mm)是发生于黑色素细胞的恶性肿瘤。广泛的局部切除是mm的基本治疗原则。手术后病理分期决定mm的预后和治疗方式。本病的突出特点是发病早期转移率高，致死性强，对单纯化、放疗敏感性差，也容易对目前化疗产生耐药。

2、黑色素瘤的基因突变发生率比较高，常见的突变基因包括braf、mapk和nras等，其中braf是一种原癌基因，约50％黑色素瘤患者携带brafv600e突变。braf突变后可激活ras/raf/mek/erk通路，从而促进肿瘤发生。对携带brafv600e的黑色素瘤患者，braf靶向抑制剂可使黑色素瘤转移灶快速消退并取得了较好疗效。其有效率高且起效快，属临床一线用药。常见的braf抑制剂有索拉非尼、威罗菲尼和达拉菲尼。索拉非尼是一种新颖靶向治疗药物，能抑制b-raf和c-raf的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，以及血小板源性生长因子受体(pdgfr)、血管内皮生长因子受体(vegfr)、p38和c-kit的多靶点酪氨酸激酶抑制剂。它通过抑制flt3和braf用于黑色素瘤的治疗，是第一个在黑色素瘤患者中被研究的raf抑制剂。但是它具有轻至中度的不良反应，主要包括皮肤毒性，腹泻和疲劳。威罗菲尼是最早进入临床的braf抑制剂，对携带brafv600e患者，它显示出比野生型高30倍的选择性抗增殖活性，起效快，有效率达48％，但是存在关节痛、光敏、疲劳和脱发等副作用。达拉菲尼与威罗菲尼疗效相当，但副作用更小。达拉菲尼也是一种强效braf抑制剂，对braf突变型的选择性是野生型braf基因的100倍，除此之外，还显示出显著的抗脑转移的临床活性。它常见的副作用包括角化过度、皮疹、头痛、发烧、脱发和周围神经病变。相对于传统治疗，braf抑制剂靶向治疗起效更快，有效率也高，但绝大多数患者都存在耐药问题，从而限制了远期疗效。除了braf抑制剂以外，还有ras/raf/mek/erk级联信号中的mek抑制剂，其中最常用的就是曲美替尼。曲美替尼是一种口服的双重激酶抑制剂，通常与达拉菲尼联合用于治疗晚期恶性黑色素瘤。有研究比较了曲美替尼与化疗的疗效，发现曲美替尼6个月生存率为81％，而使用达卡巴嗪或紫杉醇的6个月生存率为67％。曲美替尼治疗黑色素瘤的良好效果，在2013年被fda批准用于治疗brafv600e的转移性黑色素瘤。braf抑制剂单一治疗的局限性在于患者对治疗反应的差异性、几乎所有患者都会出现的耐药性以及braf抑制剂相关的毒性。在临床上，耐药性也会表现为异质性，有些转移性黑色素瘤天生对治疗药物有耐药性，而比较常见的耐药表现为最初对治疗有反应，而后产生耐药，继而出现新的转移瘤。

3、mscs是一类具有跨胚层分化潜能和自我更新能力的成纤维样组织干细胞，能够从骨髓、脂肪、巧带、胎盘、羊膜和牙髓在内的多种基质组织分离。大量实验证明，mscs通过信号通路、分泌细胞因子和分泌微泡等方式可w直接抑制肿瘤的生长。研究表明，mscs通过下调wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤细胞增殖，将荧光标记的mscs通过尾静脉注射入己通过药物刺激形成的肝细胞肝癌模型大鼠体内。通过实时定量聚合酶链式反应检测大鼠肝癌细胞信使rna水平发现，在经过mscs处理后，反应肿瘤细胞增殖情况的增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白、促进肿瘤细胞增殖的β-catenin和调亡抑制蛋白(survivin)的mrna水平均有所下降。这些实验结果表明，mscs能够影响肝癌细胞的增殖分裂与细胞周期，并且通过下调wnt信号通路抑制肿瘤细胞的增殖。

4、但是目前针对黑色素瘤的治疗还没有将braf抑制剂与mscs一起使用来治疗，该疗法有待于进一步的开展。

技术实现思路

1、本发明一方面，提供一种脂肪间充质干细胞在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

2、本发明另外一方面，提供一种特异性针对braf的单克隆抗体。

3、具体的，所述braf单克隆抗体是braf-h13。

4、进一步的，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：1所示，其氨基酸序列为ayqmtqspssvsasvgdrvtitcmfkdlwwtrekwyqqkpgkapklliysvkpcdtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycwgyhtvhvkgfhdfgggtkveik；

5、所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：2所示，其氨基酸序列为evqlvesggglvqpggslrlscaasgfslscvrniwvrqapgkglewvgwhwmkvlyfedwfqskrftiskdnskntlylqmnslraedtavyycartcvrkqncryemwwgqgtlvtvss。

6、在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据本领域常规的氨基酸替换而产生。

7、进一步的，本发明还提供了所述的braf的单克隆抗体在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

8、进一步的，本发明还提供了所述的braf的单克隆抗体和脂肪间充质干细胞在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

9、其中，黑色素瘤是a375细胞导致的。

10、进一步的，本发明的药物是包含稳定剂的纳米混悬液。

11、在一些实施方案中，稳定剂包括有机聚合物。在一些实施方案中，稳定剂包括含有纤维素或其衍生物的有机聚合物。在一些实施方案中，稳定剂包括羟丙基纤维素(hpc)或羟丙基甲基纤维素(hpmc)。在一些实施方案中，稳定剂包括有机聚合物。在一些实施方案中，有机聚合物包括聚环氧丙烷，聚环氧乙烷或其组合。在一些实施方案中，稳定剂包括含有聚乙烯吡咯烷酮或其衍生物的有机聚合物。在一些实施方案中，稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯吡咯烷酮共聚物。在一些实施方案中，稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯(pvp/va)共聚物。在一些实施方案中，稳定剂包括重均分子量为约45,000至约70,000的聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯(pvp/va)共聚物。在一些实施方案中，稳定剂包括乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯。

12、在一些实施方案中，稳定剂是通常用于口服给药的药物组合物制剂中的任何稳定剂。

13、在一些实施方案中，药物组合物包含选自聚氧乙烯硬脂酸酯，失水山梨醇硬脂酸酯，失水山梨醇倍半油酸酯，失水山梨醇单油酸酯，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，十二烷基硫酸钠(sds)的表面活性剂；或者称作月桂基硫酸钠，缩写为sls)和双(2-乙基己基)磺基琥珀酸酯，也称作磺基琥珀酸二辛酯(doss)。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。在一些实施方案中，表面活性剂是sds。在一些实施方案中，表面活性剂是doss。在一些实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯烷基醚，烷基苯基聚氧乙烯醚或聚山梨酯。

14、在一些实施方案中，药物组合物任选地包含稀释剂，填充剂或填料。在一些实施方案中，稀释剂选自山梨醇，异麦芽糖醇，甘露醇，淀粉，纤维素或其组合。

15、]在一些实施方案中，药物组合物任选地包含ph调节剂。在一些实施方案中，ph调节剂是药学上可接受的酸或碱。在一些实施方案中，ph调节剂是缓冲液。在一些实施方案中，ph调节剂是柠檬酸缓冲液，苹果酸缓冲液，马来酸缓冲液或酒石酸缓冲液。在一些实施方案中，ph调节剂是抗坏血酸，谷胱甘肽，半胱氨酸，蛋氨酸，柠檬酸，edta，苹果酸，苹果酸钠，酒石酸，酒石酸二钠或其任意组合。在一些实施方案中，ph调节剂选自维生素a，维生素c，维生素e，维生素etpgs，棕榈酸视黄酯，硒，半胱氨酸，蛋氨酸，柠檬酸，柠檬酸钠，尼泊金甲酯，尼泊金丙酯，依地酸二钠，丁基化羟基甲苯，核黄素，抗坏血酸或其组合。

16、在一些实施方案中，药物组合物任选地包含一种或多种甜味剂和调味剂以改善组合物的适口性。在一些实施方案中，所述药物组合物包含调味料，例如但不限于香草调味料或草莓调味料。在一些实施方案中，药物组合物包含甜味剂，例如但不限于三氯半乳蔗糖，阿斯巴甜，糖精钠或糖精钙。

17、在在一个实施例中，药物中的间充质干细胞使用量为0.1×106/kg至5×106/kg，1×106/kg至5×106/kg，2×106/kg至5×106/kg，3×106/kg至5×106/kg，4×106/kg至5×106/kg，0.1×106/kg至4×106/kg，0.1×106/kg至3×106/kg，0.1×106/kg至2×106/kg，0.1×106/kg至1×106/kg，1×106/kg至4.5×106/kg，1×106/kg至4×106/kg，1×106/kg至3.5×106/kg，1×106/kg至3×106/kg。

18、同时，该药物以药学有效量给药。术语“药学有效量”是指足以以适用于医疗的合理的利益/风险比治疗疾病且不会引起副作用的量，并且有效剂量水平由患者的性别，年龄和体重确定。健康状况，疾病类型，严重程度，药物活性，对药物的敏感性，给药方法，给药时间，给药途径，排泄速率，治疗周期，包括联合或伴随使用的药物在内的因素，以及其它医学领域。本领域普通技术人员可以根据已知因素容易地确定。在药物组合物的说明书中提到的术语或要素中，与已经提到的相同的术语或要素与上述相同。

19、另外，药物可以通过任何能够将活性物质转运到靶细胞的装置给药。优选的给药方式和制剂是静脉注射，皮下注射，皮内注射，肌肉注射，滴注等。注射时，水性溶剂如生理盐水溶液和林格氏溶液，植物油，高级脂肪酸酯(例如，油酸乙酯)，和非水溶剂如醇(例如，乙醇，苯甲醇，丙二醇，可包括用于防止变质的稳定剂(例如抗坏血酸，亚硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，bha，生育酚，edta等)，乳化剂，ph控制缓冲剂，以抑制微生物药物载体如防腐剂(例如苯基硝酸汞，硫柳汞，苯扎氯铵，苯酚，甲酚，苯甲醇等)的生长。

20、进一步的，本发明的药物或药物组合物中还含有治疗活性的第二治疗剂，为本领域公知的治疗活性药物都落在本发明的范围。

21、有益效果

22、本发明根据人braf不同突变体的序列，通过序列比对筛选保守性较好，具有种属特异性的序列，并且根据亲水性、免疫原性以及结果分析，最终筛选一段高免疫活性肽braf-bst，以该免疫活性肽免疫小鼠并通过杂交瘤技术制备蝴蝶特异性的具有抑制braf活性的单克隆抗体，所述抗体能够在细胞层面抑制黑色素瘤细胞的增殖，同时，在动物模型层面通过单独或者与间充质干细胞联用后也能够具有较好的抑制肿瘤增殖的效果。