本发明涉及基因工程和蛋白质工程，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术：
1、木聚糖是半纤维素（地球上位居第二的可再生资源）的一种，主要存在于植物体内，将木质素和纤维素连接起来起到了稳定植物组织结构的重要作用。同时，木聚糖也是除纤维素以外的自然界中最为丰富的多糖，结构十分复杂，单体为d-木糖，主链和侧链上都连接有大小不同的取代基团。在化石能源越来越紧缺、环境污染越来越严重的当代，科研工作者们广泛关注可再生资源的合理利用，因此，木聚糖的充分利用吸引了很多眼球，但因为木聚糖化学结构的复杂性，要想完全将木聚糖降解必须借助于一套复杂的、具有不同功能和作用方式的水解酶系。这一套负载的木聚糖降解酶系主要有β-1,4-内切木聚糖酶（β-1,4-d-xylanohydrolase：ec3.1.2.8）、β-1,4-木糖苷酶（β-1,4-dxylanxlylohydrolase：ec3.2.1.37）、α-l-呋喃阿拉伯糖苷酶（α-l-arabinofuranosidase：ec3.2.1.55）、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等，研究表明这些完整的酶系在微生物中广泛存在。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖水解过程中最重要的一种酶类，其特异性作用于木聚糖主链上的β-1，4-d-木糖苷键的糖苷键，将木聚糖彻底水解为木糖、木二糖及木二糖以上的木寡糖。
2、木聚糖酶作为木聚糖的水解催化酶，在化工、饲料、洗涤、造纸及食品等行业中用途广泛。在化工行业中，木聚糖酶可以将木聚糖水解成单糖或寡糖，为后面乙醇发酵和糠醛生产做底物层面的准备。在饲料行业，木聚糖酶能够降低谷物在动物肠道中的食糜黏度，提高饲料消化率。在洗涤行业中，木聚糖酶可作为洗衣清洁剂或衣物的护理成分。在造纸行业中，木聚糖酶在制浆和纸浆漂白中发挥着重要作用，它的使用不仅有利于制浆和纸浆漂白，也减少了化学品使用。在食品行业中，木聚糖酶则可以制备功能性寡糖，降低果汁浊度使果汁澄清，改善全麦面包的品质使面包更加柔软。
3、为了扩大碱性木聚糖酶在生产应用中的适用范围，近年来许多学者利用克隆技术和基因工程技术，对自然界中分离出来的碱性木聚糖酶的基因进行表达纯化及扩大培养，目前已取得较大进展。long 等采用双质粒共同表达的方法将来自黑曲霉( aspergillus niger) 的木聚糖酶基因转入毕赤酵母( pichia pastoris) 中表达，使其表达能力提高33%，通过优化培养条件，表达能力较摇瓶培养提高了2.4 倍，为生产中提高木聚糖酶产量提供了新的方法。jacomini 等从新月形杆菌( caulobacter crescentus) 中分离出表达木聚糖酶的xyna2基因，通过聚合酶链反应扩增，克隆到ptrchisa 载体中，在 e.coli bl21( de3) 中高效表达，纯化后的木聚糖酶在ph 值为8.0的碱性条件下培养24 h后，显示出较高的稳定性，并且能够有效地水解处理过的玉米秸秆，释放出大量还原糖和低聚木糖，这个研究为生产中利用廉价原材料高产低聚糖提供了思路与方法。yu等从一种嗜盐细菌海洋拟杆菌( marinimicrobium sp.) ls-a18中克隆了一个多结构域高分子量内切β-1，4-葡聚糖酶基因xylm18，将其在 e.coli bl21( de3)细胞中异源表达，这是目前发现的第一种多结构域、高分子量的木聚糖酶，xylm18表现出耐盐和耐碱的稳定性，可用于高盐和碱性条件下木聚糖的生物降解。li等通过构建基因片段文库，鉴定了12个不同的来自gh11家族的木聚糖酶片段序列，其中xyn22被克隆并显示出优越的耐碱性，此外，通过在y48和f53位点之间引入芳香相互作用，xyn22的热稳定性显著提高，且不损害耐碱性。
4、易错pcｒ 法是蛋白质分子改造定向进化筛选常用的技术，已被广泛应用于各类酶分子性质改良。刘俊等通过易错pcr法和双酶切载体重构建法建立了木聚糖酶基因随机突变文库，从中筛选出四个在ph 8.0～9.5 范围内相对酶活活性均比出发菌株酶活高15%左右的突变体，再将四个突变位点进行组合突变，各个组合突变体酶与底物的亲和力和催化效率都比野生型出发菌株酶高，ph稳定性也显著高于野生型酶，这为改造gh11 家族木聚糖酶xyn11a-lc 耐碱性提供了一种可行的方法，也为木聚糖酶耐碱性的研究提供了一定帮助。lai 等从嗜碱芽孢杆菌( bacillus sp.) 中分离出一种新的耐高温和耐碱的木聚糖酶xyn30y5 基因，设计了47 种突变体，其中21个突变体活性有所提高，再通过组合诱变，使得最佳突变体催化效率( kcat /km ) 和ra 601/2h值增加了一倍，同时最适ph 由7.0提高至8.0，这不仅提供了一种具有工业应用潜力的新型耐高温和耐碱的木聚糖酶，而且为提高木聚糖酶活性提供了有效的诱变策略。chen 等对木聚糖酶xyn-cdwt进行随机突变，筛选出耐碱性最强的突变株，通过对比发现，g214v及s128f 和e24v这三个突变位点使得木聚糖酶疏水性提高，突变位点n164d提高了酶的负电性，k168n也通过对带正电的l-赖氨酸的替换，间接提高了酶的负电荷，使酶的耐碱性提高。
5、汪俊卿等克隆了一种来自宇佐美曲霉( aspergillus usamii) 的木聚糖酶的基因序列，并在 p.pastoris gs115 和 e.coli bl21( de3) 中进行异源表达，在此基础上进行计算机辅助设计，通过n/c 端片段替换、二硫键添加以及点突变对该酶的热稳定性进行改造，最后获得四株热稳定性提高突变子，其最适温度比改造前的木聚糖酶提高了约2.0 ℃，该酶热稳定性得到了提高。li 等通过n-末端区域置换和定点突变的方式对来自链霉菌中的木聚糖酶进行改造，结果表明，三个突变体分别比改造前的木聚糖酶的比酶活提高了2.1倍、3.2 倍和5.3倍，突变体底物亲和力和kcat /kmax较改造前均有所提高。bai 等通过易错pcｒ 构建了含有约10 000 个克隆的木聚糖酶xyn11a-lc 随机突变文库，从文库中筛选出耐碱突变体。突变体e135v 将野生型木聚糖酶的最适ph从7.5提高至8.0，在ph 8.5、9.0、9.5 和10.0 时的相对酶活分别提高了17.5%、18.9%、14.3%和9.5%。突变体e135ｒ 将野生型木聚糖酶的最适ph 从7.5提高至8.5，突变e135v和e135ｒ分别将催化效率( kcat /km)提高了57%和37%。曹宇帆等以gh11家族木聚糖酶xyn11a-lc为基础，建立随机突变基因文库，从中筛选野生型嗜碱性明显提高的三种突变体，通过蛋白质分子模拟，对分析出的关键位点进行定点突变，最后得到了比野生型嗜碱性明显提高的三种突变体。
6、目前使用的木聚糖酶存在比酶活低、不稳定、成本高，不能满足生产需要等问题，需要通过分子改造进行性质优化。本发明即提供了一种具有高比酶活的碱性木聚糖酶，可使其更适合于在工业领域中的实际应用。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于其在工业领域的广泛应用。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供一种木聚糖酶突变体，其包含与seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：46，77，128，131，178，207。
4、在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
5、在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
6、在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：y46f、l77i、y128f、s131t、t178s、v207n。
7、本发明还提供编码上述木聚糖酶突变体的dna分子。
8、本发明还提供包含上述dna分子的重组表达载体。
9、本发明还提供一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
10、将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提升。
11、在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（ pichia pastoris）。
12、本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
13、本发明以野生型木聚糖酶h1为基础，提供了包含y46f、l77i、y128f、s131t、t178s、v207n中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶h1相比，本发明提供的木聚糖酶突变体的比活力普遍提高了9.7%-34.7%；其中，含t178s单点突变的木聚糖酶突变体的比活力最高，达1632.45 u/mg，取得了意料不到的技术效果。
14、综上，本发明提供的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低木聚糖酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。