一种米曲霉及其应用的制作方法

1.本发明属于食品加工领域，具体涉及一种米曲霉及其应用。


背景技术：

2.大豆是膳食纤维素的主要来源，它可以加速体内有害化学物质的排泄，还可以调节肠道功能。大豆可以提供多种有价值的矿物质如钙、磷、铁等，大豆和大豆产品中生物活性物质的重要性已经得到了营养学家们的认可。豆酱是我国传统发酵调味品，由米曲霉等微生物发酵豆而制成，其口感鲜咸适中，深受消费者喜爱。在豆酱发酵过程中，特别是在发酵的中后期及储存期，会逐渐出现白色结晶状物质，被称为白点，导致影响产品的感官，同时，利用米曲霉的大豆发酵中，其蛋白酶水解大豆蛋白的反应生成各种氨基酸和少量的短肽而形成独特的风味，但米曲霉选择或制曲和发酵工艺控制不当也会形成影响口感的酪氨酸、组胺、酪胺等物质。
3.专利cn2015100173024公开了一种米曲霉菌株及其在豆酱中的应用，虽然通过筛选到的米曲霉菌株降低了黄豆酱或酱油发酵过程中的白点，但由于未控制其中的影响口感和食品安全的成分含量，使之得到的豆酱或酱油被接受程度无法满足市场对食品安全性，以及口感提升的要求。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供了一种米曲霉，所述米曲霉保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc no：23273。
5.本发明还提供了一种米曲霉在制备发酵食品中的用途。
6.进一步地，所述发酵食品包括豆酱或酱油。
7.本发明还提供了一种发酵食品的制备方法，它包括步骤如下：
8.1)取黄豆，加水浸泡，蒸煮；
9.2)取蒸煮后的黄豆，加面粉混匀，接种前述米曲霉制曲，取成曲加盐水发酵，即得。
10.进一步地，步骤1)所述黄豆与水的质量体积比为1kg：2～3l；所述浸泡的时间6～12h，优选8h；所述蒸煮的温度为100～125℃，时间10～20min，优选121℃，15min。
11.进一步地，步骤2)所述黄豆与面粉的质量比为1.5～3.5：1；所述黄豆与面粉混合时的温度控制在35～45℃，优选40℃，接种时黄豆与面粉的混合物的温度控制在30～37℃，优选35℃。
12.进一步地，步骤2)所述米曲霉的接种量为黄豆和面粉的混合物总干重的1～4
‰
，g/g，优选2
‰
或3
‰
，g/g；所述制曲时通风，温度28～32℃，时间40～50h，优选温度30℃，时间42h。
13.进一步地，步骤2)所述成曲与盐水的质量比为1：1.5～3.5，优选1：2；所述盐水浓度20～25％，优选22％；所述发酵的温度30～37℃，时间70～120d，优选温度35℃，时间90d。
14.进一步地，步骤还包括取发酵所得产物，压榨过滤，取滤液静置2～5天，上清液再
过滤，即得。
15.本发明最后提供了一种前述方法所制备得到的发酵食品。
16.本发明米曲霉(aspergillus oryzae)，于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no：23273，分类命名为：米曲霉aspergillus oryzae，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
17.本发明提供的米曲霉菌株(aspergillus oryzae)az-01具有菌丝粗壮、发芽率高、高中性蛋白酶活和谷氨酰胺酶活、低酪氨酸羧肽酶，由其制备的豆酱酪氨酸含量低，无白点，且提高了原料利用率，风味好。将本发明米曲霉菌株应用于酱油发酵，得到的酱油氨基酸含量高，游离氨基酸和谷氨酸含量高，酱油中的生物胺组胺和酪胺含量低、安全水平高，原料利用率提升，风味好，具备市场推广应用价值。
18.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
19.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
20.图1米曲霉菌株(aspergillus oryzae)az-01形态
具体实施方式
21.实施例1本发明黄豆酱的制备
22.(1)原料预处理：黄豆的质量和水的体积按照1(kg)：2～3(l)的比例进行混合，浸泡8h，后沥干备用；
23.(2)蒸煮：将沥干后的黄豆，在121℃条件下蒸煮15min；
24.(3)混合拌料：将冷却至40℃的黄豆和面粉，按照2：1的质量比混合均匀；
25.(4)制曲：将黄豆和面粉的混合物冷却至35℃，接种米曲霉菌株(aspergillus oryzae)az-01，米曲霉的接入量为黄豆和面粉的混合物总干重的3
‰
，然后在30℃条件下通风，培养制曲42h，得成曲；
26.(5)发酵：将制得的成曲和浓度为22％的盐水按照质量比1：2的比例混匀，并在35℃恒温条件下发酵90d，制得黄豆酱。
27.实施例2本发明酱油的制备
28.(1)原料预处理：黄豆的质量和水的体积按照1(kg)：2～3(l)的比例进行混合，浸泡8h，后沥干备用；
29.(2)蒸煮：将沥干后的黄豆，在121℃条件下蒸煮15min；
30.(3)混合拌料：将冷却至40℃的黄豆和面粉，按照2：1的质量比混合均匀；
31.(4)制曲：将黄豆和面粉的混合物冷却至35℃，接种米曲霉菌株(aspergillus oryzae)az-01，米曲霉的接入量为黄豆和面粉的混合物总干重的2
‰
，然后在30℃条件下通风，培养制曲42h，得成曲；
32.(5)发酵：将制得的成曲和浓度为22％的盐水按照质量比1：2的比例混匀，并在35℃恒温条件下发酵90d，制得成熟酱醪。
33.(6)出油：酱醪采用酱油压榨机进行压榨，储存于罐中静置3天，抽取上清液，经硅藻土过滤得到酱油原油。
34.以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
35.试验例1米曲霉菌株的诱变育种和筛选
36.1.方法
37.(1)菌株的活化：将真空冷冻干燥法保存的米曲霉菌株(aspergillus oryzae)，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。将活化后的菌株进行斜面纯培养，传代2次。使用的出发菌株3#菌种是发明人自四川省成都市国酿食品股份有限公司的酱油生产大曲上分离纯化得到的。
38.菌株采用高盐麦芽汁培养基进行培养，由以下组分构成(以1l计)：130g麦芽汁培养基粉、食盐100g、琼脂粉20g、调节ph至6.5
±
0.5。所述培养基培养出发菌株的培养温度是32-33℃，培养时间3-4天。
39.(2)单细胞菌悬液制备：分别将5ml灭菌生理盐水加入数支米曲霉斜面中，刮洗斜面孢子，收集菌液加入玻璃珠震荡分散后，再用脱脂棉或滤纸过滤，得到孢子数为106个/ml的菌悬液。
40.孢子数采用平板计数法进行计数，脱脂棉或滤纸过滤可以使得孢子分散均匀。
41.(3)菌株诱变培养：将步骤(2)制备所得菌悬液分装到多个培养皿。各培养皿分别放置磁棒，将放置磁棒后的所述培养皿开盖放置于诱变箱磁力搅拌器上进行紫外诱变操作，所述紫外灯的功率为15瓦、紫外诱变操作时间分别为5、7、9、10、11、13、15min。诱变完成后，将菌悬液分别均匀涂布于高盐麦芽汁培养基平板上，32-33℃，培养时间2-3天，培养时间2d，得数个目标菌落。挑选在培养基上生长速度快、菌丝健壮、菌落大而饱满的单菌落进行下一步筛选。
42.(4)将步骤(3)所得的数个目标菌落，采用平板点植接种法，具体方法是用接种针蘸少许无菌生理盐水挑取斜面上少量孢子，以中间一个点的形式轻轻点种于酪蛋白培养基上，每个菌株三个平行。32.5℃培养4d,然后观测各菌株的菌落直径、透明圈大小等。透明圈的直径与菌落直径的比值hc，以hc值的大小可以反应出该曲霉产蛋白酶的能力hc＝透明圈的直径/菌落直径。酪蛋白培养基：干酪素4g，kh2p04 0.36g，mg so4
·
7h2o 0.50g，na2hpo41.07g，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000ml，ph 6.5～7.0。挑选生长速度快，圈径比大，孢子着生良好、中性蛋白酶的菌株移种在豆汁斜面培养基上，传代2次，保藏备用进行下一步筛选。
43.(5)称取5g脱脂奶粉，加入200ml无菌水溶解，另取10g琼脂粉于另一500ml三角瓶中，加水300ml，分别115℃灭菌30min。使用时在超净工作台混合，调ph至3.0，挑选透明圈/菌落直径比小的菌株用以筛选酸性蛋白酶低的曲霉菌株。
44.筛选得到一株高中性蛋白酶、低酸性蛋白酶，且具有生长速度快、繁殖能力强、产孢时间短的特性的米曲霉菌株(aspergillus oryzae)az-01。
45.将该菌株送中国科学院微生物研究所进行显微特征、rrna基因序列等数据综合分析。
46.2、结果
47.米曲霉aspergillus oryzaeaz-01菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称cgmcc)，保藏编号为cgmcc no：23273，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年10月08日。
48.该菌株的形态特征：在马铃薯葡萄糖培养基(pda)上菌落生长快，25℃黑暗条件下7天菌落直径55～60mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头白色渐变为黄绿色，初期球形，后期辐射状；菌落背面浅褐色，无水溶性色素。分生孢子梗高大，宽5.3～10.9μm，壁明显粗糙；顶囊球形，直径20～55μm，大部分表面可育；产孢结构单层或双层，瓶梗7.0～12.8
×
3.0～4.5μm；分生孢子近球形，浅黄绿色，表面光滑或略粗糙，2.8～5.5μm。未见有性孢子，具体见图1。
49.中国科学院微生物研究所根据送检菌种的培养特征、显微特征、rrna基因序列等数据综合分析，确定该菌为aspergillus oryzae米曲霉。
50.试验例2米曲霉应用比较
51.1、比较用黄豆酱和酱油
52.按实施例1制备的黄豆酱，以及制备过程中的成曲；
53.按实施例2制备的酱油，以及制备过程中的成曲；
54.将米曲霉(aspergillus oryzae)az-01换成豆酱/酱油行业通用米曲霉3.042种曲，按实施例1制备的黄豆酱，以及制备过程中的成曲；
55.将米曲霉换成豆酱/酱油行业通用米曲霉3.042种曲，按实施例2制备的酱油，以及制备过程中的成曲。
56.将米曲霉(aspergillus oryzae)az-01换成出发菌株3#菌种，按实施例1制备的黄豆酱，以及制备过程中的成曲；
57.将米曲霉换成出发菌株3#菌种，按实施例2制备的酱油，以及制备过程中的成曲。
58.2、酱油成分分析
59.孢子数测定：按《sb/t 10315-1999孢子数测定法》测定
60.发芽率测定：按《sb/t 10316-1999孢子发芽率测定法》测定
61.中性蛋白酶酶活检测方法：按照gb/t 28715-2012测定。1g大曲在40℃，ph7.2条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个中性蛋白酶活力单位(u/g)。
62.酸性蛋白酶酶活检测方法：按照gb/t 28715-2012测定。1g大曲在40℃，ph3.0条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个酸性蛋白酶活力单位(u/g)。
63.谷氨酰胺酶活力检测方法：在37℃、ph7.2的反应条件下，每1min水解谷氨酰胺产生1μmolnh3定义为1个酶活单位。10g曲料加40g磷酸盐缓冲液(ph7.2)后打浆粉碎，取浆液35g，加入0.5g谷氨酰胺，37℃磁力搅拌反应1h，反应结束后立即添加3gtca溶液(20％)终止反应，空白先添加tca溶液后再添加谷氨酰胺反应；取10g反应液检测氨含量，氨的检测方法按照gb5009.234-2016测定。
64.酪氨酸羧肽酶活力检测方法：取0.8ml底物溶液，加入0.2ml酶液，37℃反应3h。从反应液中取100μl，加入镉-茚三酮显色剂2ml，按标准曲线方法测定。酶活力定义为p h 7.0、37℃条件下，每小时每毫升粗酶液分解底物产生的酪氨酸的微摩尔数。
65.游离氨基酸含量检测方法：酱油样品吸取2.00ml，用1ml10％的磺基水杨酸沉淀蛋
白，最后用水定容至25.00ml的容量瓶中。取5ml摇匀的酱油溶液，在转速为10000r/min的条件下，离心10min。然后吸取1ml，用水稀释至25.00ml的容量瓶中，最后吸取1ml经过膜过滤的溶液进样。l-8900氨基酸自动分析仪测定。
66.氨基酸态氮、氯化钠、全氮按照gb 18186-2000进行测定。
67.组胺、酪胺：按照邹阳等的《高效液相色谱测定酱油中的生物胺含量》测定方法，样品经丹磺酰氯柱前衍生，采用高效液相色谱法测定。
68.3、结果
69.表1不同米曲霉菌株种曲质量及制曲水解酶活力分析
[0070][0071]
表1显示，米曲霉az-01菌株孢子数和发芽率比3#出发菌株、3.042提高，菌丝粗壮且生长旺盛，中性蛋白酶活、谷氨酰胺酶活力均高于出发菌株。酸性蛋白酶活力和酪氨酸酸性羧肽酶活力偏低。
[0072]
米曲霉az-01菌株和3.042菌株相比孢子数略少，菌丝粗壮且生长旺盛，中性蛋白酶活、谷氨酰胺酶活力均高于3.042菌株。酸性蛋白酶活力和酪氨酸酸性羧肽酶活力偏低。
[0073]
表2不同米曲霉菌株发酵豆酱质量分析
[0074][0075]
由表2可见，实施例1的az-01菌株酿造的豆酱胚核心指标氨基酸态氮含量相较于对照组3#出发菌株、3.042菌株制备的豆酱含量高，风味优于对照组，酪氨酸含量显著低于对照组，成品无白点。本发明提供的菌株可以明显提升氨基酸态氮的含量，提升风味，降低白点隐患。
[0076]
表3不同米曲霉菌株发酵酱油质量分析
[0077][0078]
由表3可见，实施例2的az-01菌株酿造的酱油核心指标氨基酸态氮含量、全氮、游离氨基酸、谷氨酸相较于对照组含量高，风味优于对照组3#出发菌株、3.042菌株制备的酱油，原料利用率提升，酪氨酸、组胺、酪胺含量显著低于对照组。本发明提供的菌株可以明显使得发酵的酱油氨基酸含量高，酱油中的生物胺组胺和酪胺含量低、安全水平高，原料利用率提升，风味好。
[0079]
综上，本发明米曲霉菌株应用于酱油发酵，得到的酱油氨基酸含量高，游离氨基酸和谷氨酸含量高，酱油中的生物胺组胺和酪胺含量低、安全水平高，原料利用率提升，风味好，具备市场推广应用价值。