基于DNA核酶和SELEX技术的适配体筛选方法及苯丙氨酸适配体

基于dna核酶和selex技术的适配体筛选方法及苯丙氨酸适配体
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的适配体筛选方法。


背景技术：

2.目前适配体主要是由一种名为“selex”的体外筛选技术而得到。传统的selex技术是以合成的随机dna文库开始的，需要固定配体或者适配体用于筛选，其过程十分繁琐，并耗时较长。随后，各种新的selex技术随之被开发出来，例如：对于大分子分离有效的硝酸纤维素膜过滤的selex、基因组selex(genomic selex)、small rna transcriptomic selex(smart-selex)、capture-selex等，这些改良技术使selex的应用更为广泛。但遗憾的是目前存在的selex技术仍然存在实验设计困难、筛选流程复杂等问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了基于dna核酶和selex技术的适配体筛选方法及苯丙氨酸适配体。本发明的目的一方面是解决现有的selex技术存在的问题，提出一种全新的dna适配体筛选方法，包括将ii类核酶(ii-r1)整合到筛选文库里，因而不用固定配体或者适配体，以及应用lambda exonuclease(外切酶)分离纯化单链dna，获得更纯的单链dna，提高筛选效率；另一方面，本发明筛选所用的小分子l-苯丙氨酸是苯丙酮尿症的靶标分子，在正常人血液中苯丙氨酸的量较少，而在苯丙酮尿症中则明显升高，因此测定血液中苯丙氨酸水平对于苯丙酮尿症来说具有临床参考意义。苯丙酮尿症是一种常染色体隐性遗传病，是先天性氨基酸代谢障碍中最为常见的一种，新生儿疾病筛查是降低出生缺陷的有效措施之一，目前苯丙氨酸的检测方法有滤纸法、细菌抑制试验法、高效液相-质谱法等检测血液的苯丙氨酸。这些方法或者需要昂贵的仪器设备、或者耗时长、或者准确性差，需要更快速准确的检测方法。发现一种能与l-苯丙氨酸结合的适配体的检测方法非常适合于此。适配体具有灵敏度高、特异性强的特点，可以为苯丙氨酸的检测和苯丙酮尿症的临床研究提供新的方法。
4.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
5.一种适配体筛选方法，此筛选方法将核酶发生剪切作为过滤筛选条件，将一个具有剪切功能的核酶的茎部区域修改替换成一段例如为25～40个碱基长度的随机序列(例如将ii类核酶的茎ⅱ修改替换成30个随机碱基)，此时核酶结构被打破不能发生剪切，以此建立dna文库；通过将整个dna文库进行多轮的正负筛选，筛选出当目标配体(例如l-苯丙氨酸)加入后，可与目标配体结合的随机序列发生折叠，帮助核酶恢复完整结构，核酶可以发生自我剪切。分离筛选剪切片段，并经过pcr进行扩增。经过几轮筛选富集得到与目标配体结合的适配体。
6.在一个具体的实施例中，包括如下步骤：
7.步骤一：构建dna文库，以ii类核酶茎ⅱ被替代后的序列ii-random-library(如
seq id no.1所示)建立成为dna文库；
8.步骤二：负筛孵育，将dna文库于无目标配体的体系中孵育约12小时，筛选出不发生剪切的适配体；
9.步骤三：正筛孵育，在负筛孵育后收集得到的dna文库中加入目标配体，孵育相应时间，经过筛选富集得到与目标配体结合的适配体；
10.步骤四：获取次级dna文库；
11.步骤五：illumina二代测序；
12.优选地，所述步骤二包括如下步骤：
13.1)将订购的dna文库进行溶解；
14.2)溶解后的dna文库，按照负筛孵育体系进行配置，即混合于同等体积的2
×
hepes buffer进行约12小时孵育，目的是除去没有在未加入目标配体之前即发生自我剪切的序列。
15.3)使用10％page(聚丙烯酰胺)胶分离纯化没有发生剪切的单链dna。
16.优选地，所述步骤三包括如下步骤：
17.1)加入目标配体(例如l-苯丙氨酸)。向分离纯化的没有发生剪切的单链dna文库中加入1mm目标配体，孵育时间从20min、10min递减，通过缩短孵育时间得到具有高结合效率的适配体。可以与配体结合的单链dna将发生剪切，而不结合的序列将不发生剪切。
18.2)pcr扩增。将发生剪切了的单链dna经pcr扩增后，得到新一轮筛选所需要的文库，从而实现适配体序列的富集。
19.优选地，所述步骤四包括如下步骤：
20.1)将正筛孵育剪切序列pcr扩增后所得产物，经测浓度后使用lambda exonuclease进行拆分单链；
21.2)使用5u的lambda exonuclease(外切酶)可以拆分约5μg的模板dna，于约37℃中孵育约30分钟。
22.优选地，所述步骤五包括如下步骤：
23.1)以经过lambda exonuclease进行拆分的单链作为模板，以上游引物、下游引物p5-forward(如seq id no.4所示)和p7-reverse(如seq id no.5所示)进行pcr建库；
24.2)纯化pcr产物后进行illumina二代测序，得到具体的序列信息。
25.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
26.苯丙氨酸适配体，所述苯丙氨酸适配体包括ii-r1-1、ii-r1-3或ii-r1-7中的至少一种，所述ii-r1-1的序列如seq id no.6所示，所述ii-r1-3的序列如seq id no.7所示，所述ii-r1-7的序列如seq id no.8所示。
27.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
28.本发明同时提供了如seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示的苯丙氨酸适配体在检测苯丙氨酸中的用途，但不用于疾病诊断和治疗。例如可以用于科学研究、实验室测定苯丙氨酸等。
29.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
30.本发明同时提供了检测苯丙氨酸的试剂盒，所述试剂盒包括seq id no.6、seq id no.7和seq id no.8所示的苯丙氨酸适配体中的至少一种。
31.本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
32.本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
33.本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的
±
20％范围内。
34.本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
35.1.设计巧妙：没有类似于capture selex设计时需要考虑锚定序列(docking sequence)的选择对文库固定的影响。本发明直接采用一个已知的核酶(如ii-r1 dna)，将其中的一个茎部区域替换为随机的序列，而核酶本身的5'与3'端序列就可以直接作为引物的结合位点，不用引入额外的序列。此外，进行负筛孵育时延长了孵育时间，由此进一步去除假阳性序列的富集。而且，借助lambda exonuclease彻底去除反义链，获取更纯的次级文库。核酶的选择也较自由，本发明挑选的是ii类核酶，也可以选择其他的核酶，也可以使用rna酶进行rna适配体的筛选，实验设计较为灵活。
36.2.产物特殊：由于采用核酶作为筛选过滤条件，所以得到的产物既是适配体又是人工核糖开关。作为适配体，此序列可以感应l-苯丙氨酸的含量变化，可以采用与纳米金结合的方法检测血液中l-苯丙氨酸含量；作为人工核糖开关，可以将序列插入基因的5'或3'端直接调控基因的表达。
附图说明
37.图1为本发明实施例中实验设计ii-random-library序列的示意图。
38.图2为本发明实施例的筛选流程示意图。
39.图3用于说明本发明实施例中利用lamda exonulease降解双链dna中5
′
末端带磷酸基团的反义链，获得正链。
40.图4为本发明实施例中获得的ii-r1-1 dna的序列和二级结构。
41.图5为本发明实施例中获得的ii-r1-1 dna与苯丙氨酸结合的kd。其中：a.适体与l-苯丙氨酸一起孵育，诱导的dna自我剪切片段用page gel电泳分离。b.不同浓度配体l-苯丙氨酸与适配体ii-r1-1 dna的结合亲和度kd。
42.图6为本发明实施例中获得的ii-r1-1 dna被苯丙氨酸诱导的剪切速率k
obs
。其中：a.没有配体。b.使用配体l-苯丙氨酸(100μm)。c.通过长达120分钟的时程测量k
obs
的值。
43.图7为本发明实施例中获得的ii-r1-3 dna的序列和二级结构。
44.图8为本发明实施例中获得的ii-r1-3 dna与苯丙氨酸结合的kd。其中：a.适体与l-苯丙氨酸一起孵育。b.不同浓度配体l-苯丙氨酸与适配体ii-r1-3 dna的结合亲和度kd。
45.图9为本发明实施例中获得的ii-r1-3 dna被苯丙氨酸诱导的剪切速率k
obs
。其中：a.没有配体。b.使用配体l-苯丙氨酸(100μm)。c.通过长达120分钟的时程测量k
obs
的值。
46.图10为本发明实施例中获得的ii-r1-7 dna的序列和二级结构。
47.图11为本发明实施例中获得的ii-r1-7 dna与苯丙氨酸结合的kd。其中：a.适体与l-苯丙氨酸一起孵育，诱导的dna自我剪切片段用page gel电泳分离。b.不同浓度配体l-苯丙氨酸与适配体ii-r1-7 dna的结合亲和度kd。
48.图12为本发明实施例中获得的ii-r1-7 dna被苯丙氨酸诱导的剪切速率k
obs
。其中：a.没有配体。b.使用配体l-苯丙氨酸(100μm)。c.通过长达120分钟的时程测量k
obs
的值。
具体实施方式
49.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
50.本实施例提供了一种基于dna核酶和selex技术的适配体筛选方法，采用的是ii类核酶(ii-r1)，将ii类核酶的茎ⅱ修改替换成30个随机碱基n，用以产生与特定配体结合的适配体。当核酶的茎被破坏后，其稳定性降低，不能发生剪切；而当目标配体(目标小分子)加入后，与随机序列结合后发生构象改变，核酶恢复完整结构发生剪切，然后将能与目标小分子结合的序列进行回收，通过pcr扩增和拆分单链反应得到新的dna文库，即可进行新一轮的筛选。一般通过6～12轮的筛选就能获得与配体紧密结合的适配体(本实施例获得的是异构核酶)。
51.一、实验方法
52.具体步骤如下：
53.①
构建dna文库。将ii类核酶的茎ii用n
30
代替后的ii-random-library序列作为dna文库，建库时至少需要达到1
×
10
15
数量级别的分子丰度，以保障筛选的序列的多样性，具体序列信息为：
54.ii-random-library(seq id no.1)：
55.5'-catgaccactaggagcatctttggcga-n30-ctaggggaataaatctttgggcacctagtggtcatg
56.②
负筛孵育。将dna文库在2
×
hepes缓冲液中混匀，于37℃条件下孵育12小时，反应体系如下：
57.表1负筛孵育的反应体系
[0058][0059]
将dna文库按上述反应体系进行孵育后，去除已发生反应的dna，然后将得到的所有的全长dna进行切胶纯化。
[0060]
③
正筛孵育。将上述负筛孵育所得到的全长dna加入10mm目标配体(l-苯丙氨酸)10μl(即目标配体的终浓度为1mm)(第七轮和第十五轮开始加入配体的终浓度为0.5mm和0.25mm)，在第一轮筛选中，37℃孵育20min，当page胶图上出现剪切条带后，以后筛选轮数的孵育时间减为10min。减少孵育时间的目的是筛选出具有更高结合力与更高剪切效率的序列。
[0061]
④
pcr扩增。将上述的正筛孵育的剪切dna进行切胶纯化，用24μl depc h2o溶解，通过上游引物ii-forward(seq id no.2)：5'-catgaccactaggagcatctttggcga和下游引物ii-reverse(seq id no.3)：5'-p-catgaccactaggtgcc进行pcr扩增，以此得到的dna溶液按下述反应体系与程序进行pcr扩增实验：
[0062]
表2 pcr反应体系
[0063][0064]
表3 rt后进行pcr反应程序
[0065][0066]
将得到的pcr扩增产物使用乙醇沉淀法进行纯化。
[0067]
⑤
获取次级文库。将上述通过pcr扩增得到的dna利用lambda exonuclease进行拆分单链，反应体系与程序如下：
[0068]
表4拆分单链dna反应体系
[0069][0070]
将得到的得到单链dna进行切胶纯化，以此得到新一轮筛选所需的dna文库。
[0071]
⑥
在筛选最后两轮加入目标配体的类似物p-fluoro-dl-phenylalanine进行反筛以去除类似物诱导的剪切片段，纯化不发生剪切的全长的单链dna。
[0072]
⑦
illumina二代测序。以反筛纯化后的产物2μl作为模板，以上游引物、下游引物序列为p5-forward和p7-reverse，具体序列信息为：
[0073]
p5-forward(seq id no.4)：
[0074]
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcatgaccactaggagcatctttggcg
[0075]
p7-reverse(seq id no.5)：
[0076]
5'-caagcagaagacggcatacgagatgcatatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatccatgaccactaggtgcccaaag
[0077]
通过上述的上游引物和下游引物进行建库，将pcr产物纯化后进行illumina二代测序。
[0078]
二、实验结果
[0079]
应用上述方法，筛选得到三条可以与配体结合并发生剪切的序列，ii-r1-1，ii-r1-3和ii-r1-7，具体序列信息(下划线对应的是n
30
序列部分)及其二级结构。这三个适配体和核酶组成的dna异构核酶的特征研究包括kd(结合的亲和度)和k
obs
(诱导的酶切速率)的测量结果如下：
[0080]
①
ii-r1-1的序列与结构(seq id no.6)：
[0081]
catgaccactaggagcatctttggcgagatcgggagaatcggtggcattggtgtctcctaggggaataaatctttgggcacctagtggtcatg
[0082]
图4为ii-r1-1 dna的序列和二级结构。利用mfold预测dna的二级结构和它的自由能。
[0083]
②
ii-r1-1 dna的kd值的测量，结果如图5。
[0084]
③
ii-r1-1 dna的k
obs
值的测量，结果如图6。
[0085]
④
ii-r1-3的序列与结构(seq id no.7)：
[0086]
catgaccactaggagcatctttggcgagaagactctggattcggggaccagttgctgctaggggaataaatctttgggcacctagtggtcatg
[0087]
图7为ii-r1-3 dna的序列和二级结构。利用mfold预测dna的二级结构和它的自由能。
[0088]
⑤
ii-r1-3 dna的kd值的测量，结果如图8。
[0089]
⑥
ii-r1-3 dna的k
obs
值的测量，结果如图9。
[0090]
⑦
ii-r1-7的序列与结构(seq id no.8)：
[0091]
catgaccactaggagcatctttggcgatcctcgtcagatggtgaagcagacgtttggctaggggaataaatctttgggcacctagtggtcatg
[0092]
图10为ii-r1-7 dna的序列和二级结构。利用mfold预测dna的二级结构和它的自由能。
[0093]
⑧
ii-r1-7 dna的kd值的测量，结果如图11。
[0094]
⑨
ii-r1-7 dna的k
obs
值的测量，结果如图12。
[0095]
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。