水稻多肽组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及天然活性成分技术领域，特别是涉及一种水稻多肽组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.如今，随着人们工作节奏加快，压力不断增大，胃病逐渐成为困扰人们的心头之患。胃病中又以胃炎(gastritis)较为常见，而胃炎是各种原因引起的胃黏膜炎症。
3.目前，针对胃肠道粘膜损伤，或其它如口腔等部位的黏膜损伤，常规治疗方式为抑酸治疗以及黏膜保护剂，常规治疗药物为质子泵抑制剂、消炎漱口水，主要通过抑制胃酸和黏膜表面物理覆膜的方法缓解黏膜溃疡症状，并不直接作用于黏膜修复。同时长期使用抑酸剂可能导致患者消化能力下降，可能引发微量元素缺乏、消化道炎症及腹泻等不良反应。


技术实现要素：

4.基于此，有必要针对上述问题，提供一种水稻多肽组合物的制备方法，采用该方法制备得到的水稻多肽组合物，具有较好的黏膜修复效果，适用于口腔、胃肠道等粘膜损伤导致的口腔溃疡、胃炎、胃溃疡、肠炎等的治疗。
5.一种水稻多肽组合物的制备方法，包括以下步骤：
6.前处理：取大米种子，进行破碎和研磨，得到粗制品；
7.酶解：向所述粗制品中加入第一复合酶，进行粗酶解，所述第一复合酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，得到粗酶解液，取所述粗酶解液，离心，取上清，再加入第二复合酶进行终酶解，所述第二复合酶为糜蛋白酶和胃蛋白酶，得到终酶解液；
8.纯化：将上述终酶解液进行超滤，取穿透液，得到所述水稻多肽组合物。
9.本发明人的前期研究中，由于普立米1号(广东普立米生物科技有限公司，农业植物新品种保护申请号：20181039.9)可吸收蛋白比例低于普通水稻品种，临床上将此大米给予代谢综合证患者食用。在患者实际食用的临床观察中(穗红院医伦审2017-036-02)，我们发现食用该大米的患者表现出胃肠道功能的改善，进一步分析确认，产生作用的是该水稻中的蛋白质。
10.在上述研究基础上，本发明尝试了多种方法，对该普立米1号水稻中的多肽成分进行提取，并对比不同提取方法得到的多肽活性，最终找到，以上述特定的复合酶进行消化，得到的多肽组合物具有较好的胃肠道改善功能，特别是显示出了卓越的粘膜修复效果，适用于口腔、胃肠道等粘膜损伤导致的口腔溃疡、胃炎、胃溃疡、肠炎等的治疗。
11.在其中一个实施例中，所述酶解步骤中，按照6350
±
100u第一复合酶/g大米种子的量加入第一复合酶，所述第一复合酶中碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活力单位比例为5
±
1：1；
12.按照6350
±
100u第二复合酶/g大米种子的量加入第二复合酶，所述第二复合酶中糜蛋白酶和胃蛋白酶的活力单位比例为4
±
1：1。上述u指酶活单位unit。
13.以上述复合酶进行酶解，所得多肽组合物具有较优的粘膜修复效果。
14.在其中一个实施例中，ph 8.0
±
0.5,37
±
1℃酶解25
±
5min；所述终酶解条件为：ph 5.0
±
0.5，37
±
1℃酶解25
±
5min。以上述酶解条件配合进行酶解，所得多肽组合物具有最佳的粘膜修复效果。
15.在其中一个实施例中，所述酶解步骤中，所述离心条件为：12000
±
1000rpm，离心30
±
5min。采用该离心条件，能够很好的去除杂质，得到较干净的上清液。
16.在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，超滤截留分子量为10
±
1kd。即取10kd以下的小肽。经过结合活性验证的反复筛选调整，发明人发现，以上述截留分子量进行超滤，能够在活性多肽组合物保留的前提下，达到较好的除杂作用。
17.在其中一个实施例中，所述前处理步骤中，依次包括匀浆和超声破碎步骤，所述匀浆步骤为：取大米种子破碎，用液氮研磨为粉末，加入匀浆溶剂，进行pbs缓冲液，匀浆处理，得到大米匀浆液；
18.所述超声破碎步骤为：将上述大米匀浆液置于冰水浴上超声破碎，即得粗制品。
19.以上述方法进行前处理，能够充分释放蛋白和多肽，有利于后续酶解得到活性多肽组合物。
20.在其中一个实施例中，所述匀浆步骤中，按照5
±
1ml匀浆溶剂/g大米种子的量加入匀浆溶剂，所述匀浆溶剂选自：ph 7-8的pbs缓冲液或8
±
1m的尿素溶液，匀浆时间为15
±
5min；
21.所述超声破碎步骤中，所述超声破碎时间为15
±
5min。上述单位m为mol/l。
22.在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，还将所述穿透液进行除盐处理，过滤、抽干，即得所述水稻多肽组合物。
23.在其中一个实施例中，所述大米种子为农业植物新品种保护申请号为20181039.9的普立米1号水稻品种。
24.本发明还公开了上述的制备方法得到的水稻多肽组合物。
25.本发明还公开了上述的水稻多肽组合物在制备用于预防和治疗粘膜损伤疾病的药物中的应用。
26.在其中一个实施例中，所述粘膜损伤导致疾病包括：口腔溃疡、消化道溃疡、放射性口腔黏膜炎、放射性食管炎、肠道溃疡。
27.本发明还公开了上述的水稻多肽组合物在制备用于预防和治疗高血脂的药物中的应用。
28.本发明还公开了上述的水稻多肽组合物在制备用于胃肠道双向调节的药物中的应用。
29.可以理解的，上述胃肠道双向调节指既可以治疗便秘、又可治疗腹泻，以达到肠道平衡的双向调节。
30.本发明还公开了一种药物组合物，包括上述的水稻多肽组合物，以及药学上可接受的辅料。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.本发明的水稻多肽组合物的制备方法，通过将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复配作为第一复合酶，将糜蛋白酶和胃蛋白酶复配作为第二复合酶，进行二次酶解，对大米种子中的
蛋白进行提取，得到的多肽组合物，具有较好的胃肠道改善功能，特别是显示出了卓越的粘膜修复效果，适用于口腔、胃肠道等粘膜损伤导致的口腔溃疡、胃炎、胃溃疡、肠炎等的治疗。
附图说明
33.图1为实验例中食用水稻多肽组合物a人群胃肠功能临床观察评分结果；
34.图2为实验例中食用水稻多肽组合物a人群的放射性口腔黏膜炎vas评分对比示意图。
具体实施方式
35.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
36.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
37.以下具体实施方式所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下具体具体实施方式所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。
38.碱性蛋白酶：购于上海源叶生物科技有限公司，货号为s10154-100g，规格：100g。
39.木瓜蛋白酶：购于上海源叶生物科技有限公司,货号为：s10011-25g，规格：25g。
40.糜蛋白酶：购于上海源叶生物科技有限公司,货号为：s10001-10g，规格：10g。
41.胃蛋白酶：购于上海源叶生物科技有限公司,货号为：s10027-100g，规格:100g。
42.实施例
43.本实施例考察不同方法制备得到的水稻多肽组合物。
44.一种水稻多肽组合物，取普立米1号(广东普立米生物科技有限公司，农业植物新品种保护申请号：20181039.9)水稻进行提取，并比较了不同的几种提取方法，具体如下。
45.一、复合酶消化法
46.1)前处理：按照比例，将0.2g大米种子破碎，用液氮研磨成粉末，加入1ml pbs(磷酸缓冲液，ph 7.5)，继续匀浆15分钟至匀浆充分。并将匀浆在冰水浴上超声破碎15分钟，充分释放蛋白和多肽。
47.2)酶解：按总酶活/原料为6350u/g的比例，向上述匀浆液中加入第一复合酶，该第一复合酶为活力单位比为5：1的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，在ph 8.0,37℃的条件下酶解25min，得到粗酶解液。随后在37℃,12000rpm条件下离心30分钟，取上清，上清再用第二复合酶进行终酶解，该第二复合酶为活力单位比例为4：1的糜蛋白酶和胃蛋白酶，加入量为总酶活/原料为6350u/g，在ph 5.0
±
0.5，37
±
1℃酶解25
±
0.5min。随后在37℃,12000rpm条件下离心30分钟，取上清。
48.3)纯化：用10kd的超滤管对得到的终酶解液进行超滤，取穿透液；按照常规方式对
穿透液进行除盐处理，过滤、抽干后即得水稻多肽组合物a。
49.二、模拟酶消化法
50.参照上述复合酶消化法进行消化提取，得到水稻多肽组合物b，提取方法与上述复合酶消化法的不同之处在于酶解步骤中，按照下述方式进行酶解：
51.1)前处理：按照比例，将0.2g大米种子破碎，用液氮研磨成粉末，加入1ml pbs(磷酸缓冲液，ph 7.5)，继续匀浆15分钟至匀浆充分。并将匀浆在冰水浴上超声破碎15分钟，充分释放蛋白和多肽。
52.2)酶解：按总酶活/原料为6350u/g的比例，向上述匀浆液中加入第一复合酶，该第一复合酶为活力单位比为5：1的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，在ph 8.0,37℃的条件下酶解的25min，得到粗酶解液。随后在37℃,12000rpm条件下离心30分钟，取上清。
53.纯化：用10kd的超滤管对得到的终酶解液进行超滤，取穿透液；按照常规方式对穿透液进行除盐处理，过滤、抽干后即得水稻多肽组合物b。即该水稻多肽组合物b与水稻多肽组合物a相比，省略了终酶解步骤。
54.三、超声提取法
55.以超声提取法对蛋白进行提取，得到水稻多肽组合物c，提取方法如下：
56.1)前处理：按照比例，将0.2g大米种子破碎，用液氮研磨成粉末，加入1毫升pbs(磷酸缓冲液，ph 7.5)，继续匀浆15分钟至匀浆充分。
57.2)超声提取：将匀浆在冰水浴上超声破碎15分钟，充分释放蛋白和多肽。
58.3)纯化：在4℃,12000rpm条件下离心30分钟，取上清，用10kd的超滤管对得到的上清液进行超滤，取穿透液；按照常规方式对穿透液进行除盐处理，过滤、抽干后即得水稻多肽组合物c。
59.四、水稻品种筛选
60.参照上述复合酶消化法进行消化提取，得到水稻多肽组合物d，e，提取方法与上述复合酶消化法的不同之处在于提取对象分别为为嘉花1号水稻(审定编号:浙审稻2004018)及美香占2号(审定编号：粤审稻2006009)。
61.五、截留分子量筛选
62.参照上述复合酶消化法进行消化提取，得到水稻多肽组合物f，提取方法与上述复合酶消化法的不同之处在于：采用截留分子量为30kd的超滤管进行超滤。
63.实验例
64.本实验例将上述制备得到的各水稻多肽组合物进行功能活性实验验证。
65.一、诱导大鼠口腔溃疡实验
66.1、方法
67.参照文献(化学灼烧法大鼠口腔溃疡动物模型对照优化的研究[j].中国实验动物学报,2018,26(5):554-560.doi:10.3969/j.issn.1005-4847)，大鼠在异戊巴比妥钠麻醉下使用60％冰醋酸浸润建立口腔溃疡模型。
[0068]
实验组给予0.5ml，25wt％水稻多肽组合物液每天4次涂抹，实验组包括给予水稻多肽组合物a-f的实验1组-实验6组，对照组不做特殊处理，每组10只。观察口腔溃疡愈合平均时间。
[0069]
2、结果
[0070]
结果如下表所示。
[0071]
表1.大鼠口腔溃疡实验结果
[0072]
测定组数量溃疡愈合时间(天)对照组(蒸馏水)107.8
±
2.3实验1组(水稻多肽组合物a液)103.2
±
1.2
*
实验2组(水稻多肽组合物b液)104.5
±
2.0
*+
实验3组(水稻多肽组合物c液)107.5
±
1.8
+
实验4组(水稻多肽组合物d液)107.2
±
2.7
+
实验5组(水稻多肽组合物e液)107.3
±
2.2
+
实验6组(水稻多肽组合物f液)104.3
±
1.8
*+
[0073]
注：*为p＜0.05(与对照组比较)；+为p＜0.05，(与给予水稻多肽组合物a的实验1组比较)。
[0074]
上述实验结果表明，本发明所用复合酶消化法较其他提取方法(如模拟酶消化法、超声提取法等)所得水稻多肽组合物对于大鼠口腔溃疡愈合能力最优秀(p《0.05)。普立米1号品种较其他水稻品种提取的多肽组合物(组合物d或e)有明显优势(p《0.05)。上述结果表明，普通水稻多肽不具备抗口腔溃疡的能力。从实验1组和实验6组结果可以看出，多肽组合物分子量10kd以下对于大鼠口腔溃疡愈合能力优于30kd，可能是由于较小的分子量吸收效果更好，或活性多肽分子量更小导致(p《0.05)。
[0075]
二、大鼠消化性溃疡实验
[0076]
1、方法
[0077]
参照文献(康复新液抗实验性胃溃疡作用的研究[j].中成药,2001,23(2):122-124.doi:10.3969/j.issn.1001-1528)，以无水乙醇处理小鼠构建急性胃溃疡模型诱导胃黏膜损害模型，按照上述大鼠口腔溃疡实验的分组方法进行分组，每组10只。在乙醇给药30分钟之前，实验组口服给予50mg/kg的测试制剂水稻多肽组合物液。对照组给予等量的蒸馏水。乙醇给药一个半小时后，在乙醚麻醉下处死大鼠并取出胃。给胃注射10ml的1％福尔马林并固定30分钟。在福尔马林固定以后，沿着胃大弯切开并用数码相机拍它的内表面的照片。
[0078]
2、结果
[0079]
结果如下表所示。
[0080]
表2.大鼠消化性溃疡实验结果
[0081]
测定组数量溃疡指数(％)溃疡抑制率(％)对照组(蒸馏水)1061.2
±
13.1/实验1组(水稻多肽组合物a液)1012.9
±
7.7,*78.9％实验2组(水稻多肽组合物b液)1028.3
±
14.3,*+53.5％实验3组(水稻多肽组合物c液)1056.5
±
15.2,+8.7％实验4组(水稻多肽组合物d液)1058.9
±
16.3,+3.8％实验5组(水稻多肽组合物e液)1058.2
±
7.4,+4.9％实验6组(水稻多肽组合物f液)1019.9
±
5.3,*+67.5％
[0082]
注：*为p＜0.05(与对照组比较)；+为p＜0.05，(与给予水稻多肽组合物a的实验1
组比较)。
[0083]
上述实验结果表明，本发明所用复合酶消化法较其他提取方法(如模拟酶消化法、超声提取法等)所得水稻多肽组合物对于大鼠胃溃疡愈合能力最优秀(p《0.05)。普立米1号品种较其他水稻品种提取的多肽组合物(组合物d或e)有明显优势(p《0.05)，上述结果表明，普通水稻多肽不具备抗消化性溃疡的能力。从实验1组和实验6组结果可以看出，多肽组合物分子量10kd以下对于大鼠抗消化性溃疡能力优于30kd，显示出较小的分子量吸收保护效果更好(p《0.05)。
[0084]
三、食用水稻多肽组合物a人群胃肠功能临床观察
[0085]
1、方法
[0086]
入选标准：选取长期住院的(终末期肾脏病患者ckd5期)长期进行血液净化的患者作为食用水稻多肽组合物a人群胃肠功能临床观察对象。因为这类患者需要定时返院，实验质量控制和完成率较高。同时由于该人群对于身体水分调节能力很差，通常表现为长期的胃肠道功能紊乱，是胃肠道功能状态最差的患者群体之一。入选年龄为23-85岁，胃肠道功能表(gsrs)评分较差(高于24分)，总入组人数150人。
[0087]
分组：随机分为实验组和对照组2组，每组75人。在实验期内死亡或者转院或者无法坚持服用的自动脱落。经过3个月的时间，共有143人完成实验(对照组为73人，实验组为70人)
[0088]
食用方法：实验组服用水稻多肽组合物a饮料，每次3克(以固体计，含水稻多肽组合物a为2700mg)，每天3次，随餐温水冲服。
[0089]
对照组则服用安慰剂(每次3克，以固体计，含普通大豆肽2400mg)(采购自西安百川生物科技有限公司生产的符合gbt22492-2008标准大豆肽)，每天3次，随餐温水冲服。
[0090]
2、结果
[0091]
实验结果如下表和图1所示，图1为实验组在服用水稻多肽组合物a前后评分结果，其中，黑色折线为实验组-服用前评分，灰色折线为实验组-服用后评分，横坐标为不同症状表现，纵坐标为评分，纵坐标分数越高则表示该症状表现越差，分数越接近1则表示该症状表现越少(1为最低分)。
[0092]
表2.胃肠道功能表(gsrs)评分结果(均值)
[0093]
[0094]
注：*表示与对照组-服用后相比具有统计学差异，p＜0.05；#表示与对照组-服用后相比具有统计学差异，p＜0.01。
[0095]
对照组前后p》0.05,不具备统计学差异，对照组与实验组服用前p》0.05,不具备统计学差异，该表所示所有症状均为实验组服用后与对照组-后p《0.05有统计学差异，实验组服用前后p《0.05有统计学差异。
[0096]
上述实验结果表明，食用水稻多肽组合物a(即polimi蛋白肽)的人群gsrs(胃肠道功能评价表)总评分明显优于未服用的人群(p《0.05)，水稻多肽组合物a表现出对胃部以及肠道的良好能力，对改善胃部消化功能，同时改善便秘、腹泻及大便形态方面均效果显著。这种改善变化大多数在临床观察3-5天内就发生，并在服用期间保持持续稳定状态。
[0097]
四、放射性口腔黏膜炎临床观察
[0098]
1、方法
[0099]
入选标准：头颈部放疗住院患者(头颈部肿瘤)40名，年龄20-65岁，在持续放疗过程中达到口腔黏膜炎症状达到who口腔黏膜炎2级标准(口腔黏膜出现红斑、溃疡、但能进食固体食物)，随机分组为实验组和对照组，各20名。
[0100]
基本情况：分组前溃疡面积、疼痛程度无统计学差异p＞0.05。整个实验中患者的放疗并未停止，总照射剂量66-70gy,30-35次，每周5次。
[0101]
给药方法：实验组给予水稻多肽组合物a溶液(6ml，含水稻多肽组合物a为2700mg)含服4次/天；对照组给予口服康复新液10ml+4％碳酸氢钠50ml漱口4次/天。
[0102]
分别在治疗前和治疗后7d观察溃疡面积变化。
[0103]
2、结果
[0104]
实验结果如下表和图2所示，图2为vas评分对比示意图，其中，实验组和对照组中左侧黑色柱块为治疗前vas评分值，右侧浅灰色柱块为治疗后vas评分值。
[0105]
表3.放射性口腔黏膜炎临床观察(均值)
[0106]
测定组临床治愈(例)显效(例)有效(例)无效(例)有效率实验组51230100％对照组0261240％
[0107]
总体疗效评价方法标准如下：
[0108]
有效：溃疡面积下降50％；
[0109]
显效：溃疡面积下降75％；
[0110]
治愈：溃疡创面愈合，恢复光滑；
[0111]
无效：溃疡面积无明显变化。
[0112]
疼痛感对比评估中，在用药5天后，采取视觉模拟评分法以评估疼痛程度，即疼痛评分，满分10分，以分值与10分的接近度来表示疼痛的严重程度。
[0113]
结果表示，水稻多肽组合物a对治疗放射性口腔黏膜炎与传统治疗方法相比效果非常显著。在疼痛缓解方面效果尤为明显，绝大多数患者(20名受试者中的18名)通过治疗可以在放疗期间不使用含麻醉镇痛药物，并保持经口饮食；而使用传统治疗方法，仅有5名受试者能够在放疗期间不使用含麻醉镇痛药物，因而，水稻多肽组合物a具有显著的临床应用价值，这是传统治疗方法无法比拟的。
[0114]
五、预防放射性食管炎临床观察
[0115]
预防胸部放疗放射性食管炎的临床观察实验。
[0116]
1、方法
[0117]
选取60例不同肺癌术后胸部放疗患者(对肺癌不分级)，年龄35-70岁，随机分组为实验组和对照组。总照射剂量50-66gy,25-33次，每周5次。
[0118]
给药方法：实验组给水稻多肽组合物a溶液(6ml，含水稻多肽组合物a为2700mg)4次/天，对照组不使用预防措施。观察放疗开始2个月内发生2级以上放射性食管炎的几率。从开始放疗前1天开始使用。
[0119]
2、结果
[0120]
结果如下表所示。
[0121]
表4.胸部放疗放射性食管炎的临床观察实验结果
[0122]
放射性食管炎级别数量一级二级三级对照组(30例)2081实验组(30例)720
[0123]
上述结果表明，实验组较对照组发生2级以上放射性食管炎的概率下降75％以上(p《0.01)。
[0124]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0125]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。