用于检测松材线虫的crRNA引物组、试剂盒及应用的制作方法

用于检测松材线虫的crrna引物组、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测松材线虫的crrna引物组、试剂盒及应用。


背景技术：

2.松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)引起的松材线虫病(pine wilt disease,pwd)是一种为东亚和西欧的松林带来最具毁灭性灾害的病害。其自1982年首次在中国江苏南京报道发现以来，在中国各省内迅速传播扩散。最新由《国家林业局公告(2022年第6号)》公布的数据表明，中国现共有19个省级行政区为松材线虫病发生疫区，病害发生面积达到974万亩，累计造成超过数十亿株松树死亡，同时导致上千亿元的直接或间接经济损失。这种松树上的“癌症”为林业生产和经济发展都带来了严重的影响，并且当发现松树表现出较为明显的感病症状再采取防治方法时，根本无法挽回。
3.针对松材线虫的鉴定方法很多。除了最传统的依靠贝尔曼漏斗法结合形态学显微观察外，利用分子生物学方法的各种检测方法，如近年来新兴起的依靠恒温核酸扩增技术的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lamp)或重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)等，也都成功应用于松材线虫的检测。
4.而传统的分子检测或者是近年来新兴起的环介导等温扩增技术或重组酶聚合酶扩增技术等对于松材线虫的检测都依赖于基因组dna的存在(这也是许多病害检测的常用方法，因为无论在活体或死体病害样本中都可以提取出基因组dna，实现检测需要)。但对于松材线虫来说，其在中国属于二级检疫对象，木材进出口贸易运输前一般都会进行熏蒸或热处理等，从而杀死其中的松材线虫，如果还依靠基因组dna作为对象进行检测，很有可能出现假阳性结果，进而影响贸易的进行等。如何在较短时间内实现对松材线虫活体的快速准确检测，对于林业生产、口岸进出口木材检疫具有较高的价值水平。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测松材线虫的crrna引物组、试剂盒及应用。本发明提供的crrna引物组能特异性地检测目标基因，实现对木材中松材线虫活体的快速检测，从而最大程度减少或防止对进出口木材产品的贸易限制。
6.本发明提供了一种用于检测松材线虫的crrna引物组，所述引物组包括直接重复序列和间隔向导序列；所述直接重复序列具有cas蛋白结合功能；所述间隔向导序列的靶标基因包括expansin基因。
7.优选的，所述直接重复序列包括seq id no:1。
8.优选的，所述间隔向导序列包括seq id no:2、seq id no:6、seq id no:8和seq id no:9中的一种或者多种。
9.进一步优选的，所述间隔向导序列包括seq id no:2和seq id no:8。
10.本发明提供了一种用于检测松材线虫的试剂盒，包括所述crrna引物组，还包括lwacas13a蛋白、lwacas13a缓冲液、rntp mix buffer、rnase inhibitor、depc水、ssrna fq-labeled reporter和松材线虫expansin ssrna标准品。
11.优选的，所述ssrna fq-labeled reporter的序列为5
’‑
6fam-uuuuu-bhq1-3’。
12.本发明还提供了所述crrna引物组、所述试剂盒在检测松材线虫中的应用。
13.优选的，所述应用包括如下步骤：
14.s1、提取待测样本rna，以所述待测样本rna为模板，构建松材线虫crispr/cas13反应体系；
15.s2、启动松材线虫crispr/cas13反应，恒温实时荧光检测；处理并比较荧光信号：若所述荧光信号高于检测阈值，则有松材线虫；若所述荧光信号低于检测阈值，则无松材线虫。
16.优选的，步骤s2所述恒温实时荧光检测的温度为37℃；步骤s2所述处理并比较荧光信号的时间为启动反应后的15-20min。
17.优选的，所述应用包括如下任意一种：
18.(1)显示出感病症状但未确定是否包含松材线虫的林木检测；
19.(2)经过贝尔曼漏斗法获取的线虫悬浮液但并未确定是否包含松材线虫的样品检测；
20.(3)确定含有松材线虫但并未确定是否包含活体松材线虫的林木检测。
21.有益效果：
22.本发明提供了一种用于检测松材线虫的crrna引物组、试剂盒及应用。所述crrna引物组、试剂盒通过特异性地检测松材线虫活体中的expansin基因，能实现对松材线虫活体的快速准确筛查。将本发明所述crrna引物组、试剂盒应用于松材线虫检测，具有特异性强，检测效率高的特点，能有效防止活体线虫随松木及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延，对于口岸检测及实际应用具有极好的推广使用前景。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
24.图1是本发明实施例1松材线虫各crrna引物组实时荧光法检测效果评价曲线图；
25.图2是本发明实施例1松材线虫crrna1+crrna7引物组合的实时荧光法检测效果评价对比图；
26.图3是本发明实施例2松材线虫crispr/cas13无扩增检测体系实时荧光检测特异性评价曲线图。
具体实施方式
27.本发明提供了一种用于检测松材线虫的crrna引物组。
28.在本发明中，所述引物组包括直接重复序列和间隔向导序列；所述直接重复序列具有cas蛋白结合功能。cas蛋白可以在crrna的引导下产生rnase活性，在靶标rna单链上产生多个切割位点，同时具有碱基偏好性，对于特定碱基小分子序列具有rnase反式切割活
性。在本发明中，所述cas蛋白优选包括cas13a蛋白酶、cas13b蛋白酶、cas13c蛋白酶和cas13d蛋白酶中的任意一种，更优选包括cas13a蛋白酶。在本发明中，所述直接重复序列优选包括seq id no:1。
29.在本发明中，所述间隔向导序列的靶标基因包括expansin基因。所述间隔向导序列能与松材线虫活体细胞中存在的松材线虫扩张蛋白expansin基因rna特异性匹配。在本发明中，所述间隔向导序列优选包括seq id no:2、seq id no:6、seq id no:8和seq id no:9中的一种或者多种；更优选包括seq id no:2和seq id no:8。
30.本发明提供的crrna引物组以松材线虫扩张蛋白expansin基因作为松材线虫检测的靶标基因。其中expansin基因仅在咽部腺细胞中表达，在宿主-寄生虫相互作用中起作用，可在寄主中协助线虫迁移传播和扩散。且expansin蛋白由碳水化合物结构域和扩张蛋白结构域融合而成，但在囊肿线虫、根结线虫、松材和拟松材线虫内，该蛋白不含有碳水化合物结构域，经过对松材和拟松材该基因序列进行比对，发现存在部分序列差异，因此选择其作为靶标序列检测松材线虫。
31.本发明利用cas蛋白的反式切割活性，使cas蛋白在crrna的引导下对报告分子进行切割，实现对松材线虫活体的快速准确筛查，从而实现对木材中松材线虫的存活与否判断，最大程度减少或防止对进出口木材产品的贸易限制。
32.本发明提供了用于检测松材线虫的试剂盒，包括所述crrna引物组，还包括lwacas13a蛋白、lwacas13a缓冲液、rntp mix buffer、rnase inhibitor、depc水、ssrna fq-labeled reporter和松材线虫expansin ssrna标准品。其中，所述ssrna fq-labeled reporter的5’端优选标记有fam报告基团，3’端优选标记有bhq1报告基团；所述ssrna fq-labeled reporter的序列优选为5
’‑
6fam-uuuuu-bhq1-3’。
33.本发明所述试剂盒通过构建crispr/cas13a的37℃恒温荧光反应体系以实现具体的检测功能。在本发明中，所述crispr/cas13a反应体系优选为20μl体系：crrna引物组(10ng/μl)2μl、lwacas13a蛋白(10μm)1μl、lwacas13a缓冲液2μl、rntp mix buffer 1μl、rnase inhibitor 0.5μl、depc水9μl、ssrna fq-labeled reporter 2.5μl和松材线虫expansin ssrna标准品2μl。
34.本发明提供的试剂盒以crispr/cas13系统为基础，利用所述crrna引物组对松材线虫的expansin基因作无扩增检测，具有特异性强，检测效率高的优点。同时，本发明提供的试剂盒在成功检测出松材线虫的基础上对于其携带寄主或林木是否含有活体松材线虫也进行了快速准确的筛查，防止活体线虫随松木及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延，对于口岸检测及实际应用具有极好的推广使用前景。
35.本发明还提供了所述crrna引物组、所述试剂盒在检测松材线虫中的应用。
36.在本发明中，所述应用优选包括如下任意一种：
37.(1)显示出感病症状但未确定是否包含松材线虫的林木检测；
38.(2)经过贝尔曼漏斗法获取的线虫悬浮液但并未确定是否包含松材线虫的样品检测；
39.(3)确定含有松材线虫但并未确定是否包含活体松材线虫的林木检测。
40.在本发明中，所述应用在检测松材线虫时的操作方法优选包括如下步骤：
41.s1、提取待测样本rna，以所述待测样本rna为模板，构建松材线虫crispr/cas13反
应体系；
42.s2、启动松材线虫crispr/cas13反应，恒温实时荧光检测；处理并比较荧光信号：若所述荧光信号高于检测阈值，则有松材线虫；若所述荧光信号低于检测阈值，则无松材线虫。
43.进一步的，本发明步骤s2所述恒温实时荧光检测的温度优选为37℃；步骤s2所述处理并比较荧光信号的时间优选为启动反应后的15-20min，更优选为18min。
44.步骤s2所述荧光信号的收集频率优选为每分钟收集一次。
45.步骤s2所述荧光信号优选使用实时荧光pcr仪进行结果判读，按照以下标准进行分析判定：
46.阴性判断标准：处理后的每个时间点的相对荧光值低于或等于检测阈值；
47.阳性判断标准：处理后的每个时间点的相对荧光值低于或等于检测阈值。
48.阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入非松材线虫rna作为模板的阴性信号组。
49.更进一步地，本发明所述阴性信号组可以以水替代模板。
50.本发明提供的应用方法是一种松材线虫新型核酸快速检测方法，摆脱了对传统扩增反应的依赖，具有操作简便，稳定性高、特异性强、耗时短、检测效率高等优点，对于木材运输过程中的活体松材线虫检测具有重要意义。
51.下面结合实施例对本发明提供的用于检测松材线虫的crrna引物组、试剂盒及应用进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
52.若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
53.本发明所涉及的材料：松材线虫样本及其近缘种拟松材线虫样本，由中科院动物研究所研究室提供；crrna和ssrna信号报告探针，由上海生工生物有限公司合成；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
54.本发明所涉及的仪器：离心机、金属浴、涡旋仪、实时荧光定量pcr仪。
55.实施例1用于松材线虫的crispr/cas13a无扩增检测引物crrna的设计及筛选
56.1、靶标序列的选定
57.本发明经过多重筛选和比对，以松材线虫和其近缘种拟松材线虫的expansin基因选定为靶标序列(accession number:ab374536.1,ab374538.1)，该靶标基因在松材线虫种内保守，与拟松材线虫种间差异极大，可以将松材线虫特异性检出。
58.2、特异性靶向松材线虫expansin基因的crrna的设计
59.对于lwacas13a crrna的设计遵循以下四个原则：
60.(1)crrna包括间隔序列(spacer)和直接重复序列(direct repeat，dr),序列格式为：5
’‑
与lwacas13a蛋白结合的直接重复序列-crrna间隔序列-3’，lwacas13a对应的直接重复序列为gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac；
61.(2)将直接重复序列与间隔序列连接，构成完整的crrna序列；
62.(3)crrna的间隔序列与靶标rna中的目标位点序列反向互补。
63.(4)crrna的间隔序列长度为28个碱基，其与靶标rna的序列识别具有碱基偏好性，偏向于识别碱基“u”；
64.针对已有的松材线虫和拟松材线虫expansin基因的靶标序列比对结果，根据crrna的设计原则，设计得到8条crrna特异性引物，其核苷酸序列如下：
65.crrna1：序列1+序列2
66.序列1：
67.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
68.序列2：augaugccaacagcgacaacaaguagac
69.crrna2：序列1+序列3
70.序列1：
71.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
72.序列3：ucuggucggcgaugacaaaugaugccaa
73.crrna3：序列1+序列4
74.序列1：
75.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
76.序列4：caaguuuugcacauccagaccacaagcc
77.crrna4：序列1+序列5
78.序列1：
79.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
80.序列5：ccauuggagucgaagaggcuuccagaca
81.crrna5:序列1+序列6
82.序列1：
83.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
84.序列6：gauucgagggcacccauugaccauugga
85.crrna6:序列1+序列7
86.序列1：
87.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
88.序列7：aaugtaucuuccgucaggcagauucgag
89.crrna7:序列1+序列8
90.序列1：
91.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
92.序列8：acugggucauccaaaauguaucuuccgu
93.crrna8:序列1+序列9
94.序列1：
95.gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac
96.序列9：ugccucggcaaacugggucauccaaaau
97.3、crrna的制备
98.为方便实验保存及扩增的需要，本发明将crrna合成为dna序列，实际使用时利用体外转录的方法使dna转录为rna；体外转录方法要求在合成的dna序列5’添加t7启动子序列(gaaattaatacgactcactataggg)。该dna序列由上海生工生物工程有限公司合成，具体见表1。
99.表1用于制备松材线虫crrna的模板序列(ol igo dna)
[0100][0101][0102]
使用rtaq 10x pcr buffer(takara)将crrna的oligo dna模板退火成双链dna。
[0103]
退火体系为：oligo dna 1μl，t7 promoter 1μl，standard taq buffer 1μl，depc h2o 7μl。(10μl体系)
[0104]
上述反应体系中，oligo dna和t7 promoter的浓度为100μm，standard taq buffer浓度为10x。
[0105]
退火程序如下所示：
[0106]
95℃5min；94℃to 25℃(0.1℃/s)；25℃∞。
[0107]
根据hiscribe t7 quick high yield rna synthesis kit(new england biolabs)的说明，利用t7 rna聚合酶，将上一步得到的退火产物dsdna(crrna)进行转录，得到crrna。
[0108]
转录体系为：rnase-free h2o 17μl，ntp buffer mix 10μl，t7 rna polymerase mix 2μl，dsdna(crrna)1μl。(30μl体系)
[0109]
上述反应体系中，ntp buffer的终浓度为6.7mm，dsdna(crrna)的终浓度为1μg/μl。
[0110]
转录反应程序如下所示：
[0111]
37℃孵育16h
[0112]
在反应体系中加入20μl无核酸酶水，吸打混匀后加入2μl dnaseⅰ[0113]
37℃孵育15min
[0114]
转录反应完成后，利用rna clean&concentrator kit进行crrna的体外纯化；nanodrop2000测纯化后的crrna的浓度，使用depc水将crrna的浓度稀释至10ng/μl(将稀释好的crrna分装成20μl每管，-80℃保存，便于后续使用)。
[0115]
4、crispr/cas13a无扩增反应
[0116]
crispr/cas13a无扩增检测反应按照如下反应液配比构建20μl的反应体系：
[0117]
表2 crispr/cas13a反应体系
[0118][0119]
上述试剂依次加入到rnase-free八连排离心管后，离心混匀。
[0120]
阴性对照设置为depc水代替表2中的模板rna，且保持其他试剂组分不变。
[0121]
5、松材线虫expansin基因ssrna片段制备
[0122]
以(中科院动物研究所提供)的松材线虫为材料，使用ctab法提取松材线虫基因组dna，-20℃保存。
[0123]
以得到的dna为模板，对bx-expansin基因片段进行常规pcr反应，获长度700bp的单一条带。
[0124]
pcr反应体系为：2
×
san taq pcr mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，dna模板1μl，depc h2o 20μl。(50μl体系)
[0125]
上述反应体系中，上下游引物浓度均为10μm。
[0126]
pcr反应程序如下所示：
[0127]
94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，35cycles；72℃10min；4℃∞。
[0128]
将获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收并通过琼脂糖凝胶电泳检测回收效果。
[0129]
对bx-expansin基因pcr回收产物进行转录，获得bx-expansin ssrna阳性对照。
[0130]
转录体系为：bx-expansin回收产物11μl，ntp buffer mix 10μl，t7 polymerase 2μl，rnase h2o 17μl。(40μl体系)
[0131]
上述反应体系在37℃条件下孵育16h，完成转录反应。然后利用rna clean&concentrator kit进行纯化；使用nanodrop2000测纯化后的bx-expansin ssrna浓度,-80℃保存，便于后续使用。
[0132]
6、crispr/cas13a无扩增反应crrna引物筛选
[0133]
以获取的bx-expansin ssrna片段为靶标，对crispr/cas13反应中所需的关键引物crrna进行筛选。
[0134]
按照crispr/cas13a反应体系各反应液配比进行样品配制，除crrna外，保持其余各组分均相同；阴性对照设置为depc水代替反应体系中的模板rna，且保持其他试剂组分不变。
[0135]
恒温实时荧光检测结果对比情况见图1。根据图1的检测结果显示，crrna1和crrna7引物组都迅速可以在20min内对松材线虫rna实现检测结果，且相对荧光值较其它crrna引物组结果明显较好。
[0136]
本发明尝试加入等量crrna引物组(crrna1和crrna7的添加量是都是1μl，浓度都是10ng/μl；不改变lwacas13a酶：crrna的摩尔比)观察检测反应，恒温实时荧光检测结果对比情况见图2。根据图2的检测结果显示，crrna1+crrna7引物组在前30min的检测效果比单条crrna引物检测效果好，荧光反应数据值较高，在终点60min时，检测效果和单条crrna引物组效果几乎一致。
[0137]
实施例2 crispr/cas13a无扩增检测反应特异性试验
[0138]
1、试验方法
[0139]
用试剂盒法提取松材线虫和拟松材线虫总rna。
[0140]
将获得的松材线虫和拟松材线虫总rna为模板，并应用实施例1已经建立的体系进行crispr/cas13a无扩增反应特异性实时荧光检测，同时设置阴性对照，验证该方法的特异性。
[0141]
将反应管放入实时荧光pcr仪，反应程序为37℃，60min；每1min读取一次荧光反应值。若荧光反应值经过计算处理后高于反应阈值，则判断为阳性(有活体松材线虫)，若荧光反应值经过计算处理后低于反应阈值，则判断为阴性(无活体松材线虫)。
[0142]
2、试验结果
[0143]
分别检测松材线虫和拟松材线虫对crispr/cas13a实时荧光检测的特异性进行评估。
[0144]
检测结果如图3所示，仅在检测松材线虫的荧光反应结果高于反应阈值，结果判断为阳性，检测拟松材线虫的荧光反应结果低于反应阈值，结果判断为阴性；这些检测结果证明本发明建立的检测方法特异性良好。
[0145]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。