非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用

本发明涉及非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用，属于生物医药。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，致死率高达100％。世界动物卫生组织将其规定为必须上报的动物疫病，在我国也属于一类动物疫病。目前该病尚无有效的疫苗和药物，因此，建立高效的非洲猪瘟检测方法非常重要。

2、asfv是非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属家族的唯一成员，也是唯一的dna虫媒病毒。病毒基因组为双股线状dna，大小170～190kb。在其基因组结构中，中间125kb为保守区，两端为可变区。该病毒含有160～175个开放阅读框(orf)，编码150～200种蛋白质。其中，p30蛋白由cp204l基因编码，参与病毒内化，在病毒进入宿主细胞的过程中起重要作用。研究表明，p30蛋白较为保守，在感染早期表达，感染后4h即可在细胞浆中检测到，感染后8天，即可在猪体内检测到p30抗体。而且，p30蛋白具有良好的抗原性。p30蛋白的这些种特性，使其成为较为理想的非洲猪瘟病毒检测靶点之一。

3、抗原表位是能够被相应免疫细胞上受体识别并结合诱导免疫应答的多肽。鉴定非洲猪瘟病毒蛋白的抗原表位对于解析病毒与宿主相互作用机制和免疫机制具有重要意义，同时还可为检测方法和疫苗的研制奠定基础。因此，本发明鉴定了p30蛋白的抗原表位，并通过体外合成的方法对该抗原肽的应用进行了初步探究。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其在检测非洲猪瘟病毒抗体中的应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、本发明发明人将原核表达的重组p30蛋白纯化后，免疫balb/c小鼠。然后制备杂交瘤细胞，利用间接elisa筛选出2株阳性细胞株，分别命名为4f2和7f3。4f2和7f3分泌的单克隆抗体重链的亚型分别为igg1和igg2b，轻链均为κ链。westernblot实验结果表明，2株单克隆抗体均能与重组p30蛋白发生特异性反应。进一步通过westernblot和间接免疫荧光反应证实，4f2和7f3能特异性识别病毒感染。利用截短表达鉴定4f2和7f3针对的抗原表位分别为118sfetl122(seq id no:1)和76ehqaqeewnmilhv89(seq id no:2)。将合成并偶联卵清白蛋白(ova)的抗原表位肽利用elisa包被液进行包被，以非洲猪瘟标准阳性血清、阴性血清和pbs为一抗，兔抗猪hrp-igg为二抗，进行elisa，经tmb显色后，读取od450值。结果显示合成抗原表位多肽与阳性血清反应的od值明显高于阴性血清和pbs，说明抗原表位多肽可用于非洲猪瘟病毒感染的诊断和检测。

4、在上述研究的基础上，本发明提出了一种非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽，所述抗原表位多肽的氨基酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

5、本发明还提供了编码所述的抗原表位多肽的多核苷酸，优选的，所述的多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:3或seq id no:4所示。

6、含有所述的多核苷酸的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也应属于本发明所要求保护的范围。

7、进一步的，本发明还提出了所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂中的应用。

8、更进一步的，本发明还提出了一种非洲猪瘟病毒抗体检测elisa试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽。

9、其中，优选的，所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽是与卵清白蛋白相偶联。

10、其中，优选的，所述的试剂盒中还含有酶标板、elisa包被液、洗涤液、封闭液、hrp标记的兔抗猪igg二抗、显色液以及终止液。

11、其中，优选的，所述的elisa包被液为0.05m碳酸盐缓冲液，ph9.6；所述的洗涤液为含0.1％v/v吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述的封闭液为兔血清；所述的显色液为tmb显色液。

12、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

13、本发明鉴定了非洲猪瘟病毒p30蛋白新的抗原表位肽，丰富了该蛋白的表位信息。该抗原表位多肽的鉴定为建立高效检测非洲猪瘟病毒的方法提供了依据，同时也为研究p30蛋白的结构和功能奠定了基础。

技术特征：

1.一种非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽，其特征在于，所述的抗原表位多肽的氨基酸序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

2.编码权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如seq idno:3或seq id no:4所示。

4.含有权利要求2或3所述的多核苷酸的表达载体。

5.含有所述权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂中的应用。

7.一种非洲猪瘟病毒抗体检测elisa试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽。

8.如权利要求7所述的非洲猪瘟病毒抗体检测elisa试剂盒，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽是与卵清白蛋白相偶联。

9.如权利要求8所述的非洲猪瘟病毒抗体检测elisa试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有酶标板、elisa包被液、洗涤液、封闭液、hrp标记的兔抗猪igg二抗、显色液以及终止液。

10.如权利要求9所述的非洲猪瘟病毒抗体检测elisa试剂盒，其特征在于，所述的elisa包被液为0.05m碳酸盐缓冲液，ph9.6；所述的洗涤液为含0.1％v/v吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述的封闭液为兔血清；所述的显色液为tmb显色液。

技术总结
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位肽及其应用。本发明以非洲猪瘟病毒p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备杂交瘤细胞。利用间接ELISA方法筛选出2株能够稳定分泌抗p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为4F2和7F3。鉴定结果表明，2株细胞分泌的单克隆抗体均能与p30重组蛋白发生特异性反应，且可与非洲猪瘟病毒发生特异性反应。利用截短表达的方法分别鉴定2株单克隆抗体针对的抗原表位。结果显示，4F2针对的表位为SEQ ID NO:1所示，7F3针对的表位为SEQ ID NO:2所示。本发明还涉及该抗原表位肽在制备检测非洲猪瘟病毒抗体试剂中的应用，本发明的提出为非洲猪瘟病毒的高效检测提供了技术手段。

技术研发人员：文雪霞,张莹,于思慧
受保护的技术使用者：沈阳农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12