人源化的抗人PD-1抗体的制作方法

本发明涉及免疫学和免疫治疗领域，特别是在人类疾病的治疗中。更具体地，本发明涉及用于治疗人类疾病的人源化抗人pd-1抗体或其抗原结合片段。

背景技术：

1、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，也称为cd279)是一种细胞表面蛋白分子，其属于免疫球蛋白超家族。pd-1在t和b淋巴细胞和巨噬细胞上表达，并在细胞命运和分化中发挥作用。特别地，pd-1作为免疫检查点，通过阻止t细胞的激活，在下调免疫系统中发挥重要作用，从而降低自身免疫并促进自我耐受。已鉴定出pd-1的两种配体，即pd-l1和pd-l2，其已被证明在结合至pd-1后可下调t细胞激活，在t细胞中诱导共抑制信号并促进其凋亡、失能和功能耗竭(freeman等，(2000)j exp med 192:1027-34；latchman等，(2001)nat immunol2:261-8；carter等，(2002)eur j immunol 32:634-43)。配体pd-l1和pd-l2在正常人细胞中不表达，但在多种人类癌症中可大量存在(dong等，(2002)nat med 8:787-9,brahmer等，n eng j med,366(26),2012；topalian等，n eng j med,366(26),2012；wolchok等，n englj med.2013jul 11；369(2):122–133))。pd-l1比pd-l2更广泛地表达，并且由多种造血细胞和非造血细胞表达。

2、肿瘤、微生物和病毒采用诸如pd-l1/pd-1的共抑制途径，通过建立免疫抑制微环境来避开免疫防御和免疫监视。特别地，由肿瘤、微生物或病毒引起的pd-l1/pd-1途径可通过多种机制来逃避宿主的免疫监视，所述机制包括：促进t细胞失活、疲乏、无应答和凋亡，诱导t-reg细胞扩增，以及增强肿瘤抵抗杀伤和凋亡的内在能力。由癌细胞介导的pd-1和pd-l1的相互作用也导致肿瘤浸润淋巴细胞减少，通过减少tcr下游信号抑制t细胞受体介导的t细胞增殖，导致激活和细胞因子产生减少(dong等，j.mol.med.2003,81:281-7；blank等，cancer immunol.immunother.2005,54:307-314；konishi等，clin.cancer res.2004,10:5094-100)。已在很多原发性肿瘤组织活检中发现了pd-1在肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤细胞中表达(ribas a.cancer discov.2015,5(9):915-9)。

3、鉴于其免疫抑制作用，已开发出pd-1抑制剂来抵消这种对人免疫系统的有害影响。此类pd-1抑制剂据信可以激活免疫系统以攻击肿瘤或受感染的细胞，因此可用于治疗癌症和疾病。事实上，使用pd-1或pd-l1抑制剂来破坏其之间相互作用的策略已显示出改善癌症免疫疗法的潜力(brahmer等，n eng j med,366(26),2012；powles等，nature,515(7528),2014；topalian等，n eng j med,366(26),2012；ansell,curr opin hematol,22(4),2015)。特别地，阻断pd-1与其配体之间的相互作用增强了能够消除肿瘤细胞的肿瘤特异性cd8 t细胞免疫(topalian s.等，curr opin immunol.2012,24(2):207-12)。pd-1的抑制作用也是通过促进淋巴结中抗原特异性t细胞凋亡同时减少调节性t细胞凋亡的双重机制实现的。

4、本领域公知使用对pd-1/pd-l1阻断特异的单克隆抗体(“mab”)来抵消pd-1/pd-l1信号通路的免疫抑制作用。然而，重大的实际问题阻碍了其在人体中的广泛应用。一个主要问题是非人类来源的单克隆抗体通常具有免疫原性，从而限制了其有效性，并且在一些情况下会引起危险的过敏反应。对此类外源mab的免疫应答包括产生特异性、高亲和性的抗体，这些抗体结合并影响mab的消除，从而通过促进mab从体内清除并抑制其与靶向抗原结合的能力而显著降低mab的有效性。为了克服这个问题，可以将目标非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体(通常是小鼠抗体)的特异性和亲和性。此类人源化抗体通常包含一个或多个可变结构域，其中抗原结合结构域来源于非人抗体，以及框架区来源于人或人源化抗体序列。

5、因此，需要开发人源化抗体以提供用于安全免疫疗法(特别是针对癌症，靶向人pd-1)的改进的药剂。

技术实现思路

1、本发明基于特异性靶向人pd-1的人源化抗体的开发，该抗体显示出对pd-1的高结合亲和性并与其配体pdl-1和/或pdl-2的强烈竞争。这种人源化抗体经过工程改造，在基于哺乳动物细胞的生产系统中具有很高的可制备性和产量。这种人源化抗体在本文中特别地称为“hkld”。

2、此外，申请人已经观察到抗体的实质和出乎意料的作用，导致巨噬细胞对不表达pd-l1的肿瘤细胞的吞噬作用，该抗体具有良好(promising)的疗效，特别是用于治疗pd-l1阴性肿瘤和/或具有t细胞免疫应答缺陷的患者。

3、在具体实施方式和在实施例中特别显示和解释了强烈的有益和意料不到的效果。

4、在第一个方面中，人源化单克隆抗人pd-1抗体或其抗原结合片段包含：

5、(i)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述hcdr1包含seq id no:1的氨基酸序列或由seq id no:1的氨基酸序列组成，所述hcdr2包含seqid no:2的氨基酸序列或由seq id no:2的氨基酸序列组成，和所述hcdr3包含seq id no:9的氨基酸序列或由seq id no:9的氨基酸序列组成，和

6、(ii)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述lcdr1包含seq id no:12的氨基酸序列或由seq id no:12的氨基酸序列组成，所述lcdr2包含seqid no:13的氨基酸序列或由seq id no:13的氨基酸序列组成，和所述lcdr3包含seq idno:14的氨基酸序列或由seq id no:14的氨基酸序列组成，

7、其中所述抗体或其抗原结合片段是人pd-l1和/或pd-l2与人pd-1结合的拮抗剂。

8、在第二个方面中，人源化单克隆抗人pd-1抗体或其抗原结合片段包含：(a)vh，其包含选自seq id no:21的氨基酸序列或由选自seq id no:21的氨基酸序列组成；和(b)vl，其包含seq id no:24的氨基酸序列或由seq id no:24的氨基酸序列组成。

9、优选地，所述抗体或其抗原结合片段是人pd-l1和/或pd-l2与人pd-1结合的拮抗剂。

10、在一个特别的方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含-(a)重链，其包含选自seqid no:31的氨基酸序列或由选自seq id no:31的氨基酸序列组成，其任选地具有一个、两个或三个选自在seq id no:31的除位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112以外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含seq idno:34的氨基酸序列或由seq id no:34的氨基酸序列组成，其任选地具有一个、两个或三个选自在seq id no:34的除位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105以外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。

11、在一个特别的方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定结构域的重链恒定结构域。

12、在一个更具体的方面，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人igg1重链恒定结构域的重链恒定结构域，其任选地具有选自以下的置换或置换的组合：t250q/m428l；m252y/s254t/t256e+h433k/n434f；e233p/l234v/l235a/g236a+a327g/a330s/p331s；e333a；s239d/a330l/i332e；p257i/q311；k326w/e333s；s239d/i332e/g236a；n297a；l234a/l235a；n297a+m252y/s254t/t256e；k322a和k444a，优选地选自以下：n297a，其任选地与m252y/s254t/t256e组合，和l234a/l235a。

13、在另一个更具体的方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人igg4重链恒定结构域的重链恒定结构域，其任选地具有选自以下的置换或置换的组合：s228p；l234a/l235a、s228p+m252y/s254t/t256e和k444a。

14、优选地，抗体或其抗原结合片段以等于或低于10-7m的对人pd-1的结合亲和性常数(kd)特异性结合至人pd-1，所述亲和性优选地通过生物传感器分析确定。

15、特别地，抗体或其抗原结合片段具有等于或大于85％，优选地等于或大于88％的人源化(t20)和/或在哺乳动物细胞中具有高产量。

16、在第二个方面中，本发明关于一种分离的核酸分子或分离的核酸分子组，其编码如本文公开的抗体或其抗原结合片段。

17、在第三个方面中，本发明关于一种载体，其包含如本文公开的分离的核酸分子或分离的核酸分子组。

18、本发明还关于一种宿主细胞，其包含根据本发明的分离的核酸分子和/或分离的核酸分子组和/或载体。

19、在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养如本文公开的宿主细胞的步骤，和任选地分离抗体或抗原结合片段的步骤。

20、在另一个方面中，本发明关于一种药物组合物，其包含如本文公开的抗体或其抗原结合片段和/或分离的核酸分子和/或分离的核酸分子组和/或载体和/或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

21、任选地，药物组合物还包含另外的治疗剂，所述另外的治疗剂优选地选自以下：烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、特别是抗肿瘤靶向抗体、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路激活剂、bcr-abl激酶抑制剂、bite(双特异性t细胞接合剂)抗体、抗体药物缀合物、生物应答调节剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、dvd、白血病病毒癌基因同源物(erbb2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(hsp)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(iap)的抑制剂、嵌入型抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂、microrna、丝裂原激活的胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎药(nsaid)、聚adp(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(parp)抑制剂、铂类化学治疗剂、polo样激酶(plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类维生素d植物生物碱(deltoidsplant alkaloids)、小抑制性核糖核酸(sirna)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂、低甲基化剂、检查点抑制剂、肽疫苗等、来自肿瘤抗原的表位或新表位以及这些药剂的一种或多种的组合。

22、特别地，抗体或其抗原结合片段、药物组合物、分离的核酸分子或分离的核酸分子组、载体或宿主细胞，其用作药物。

23、任选地，抗体或其抗原结合片段、药物组合物、分离的核酸分子或分离的核酸分子组、载体或者宿主细胞，其用于与放射疗法或另外的治疗剂联合使用，所述另外的治疗剂优选地选自以下：烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、特别是抗肿瘤靶向抗体、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路激活剂、bcr-abl激酶抑制剂、bite(双特异性t细胞接合剂)抗体、抗体药物缀合物、生物应答调节剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、dvd、白血病病毒癌基因同源物(erbb2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(hsp)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(iap)的抑制剂、嵌入型抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂、microrna、丝裂原激活的胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎药(nsaid)、聚adp(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(parp)抑制剂、铂类化学治疗剂、polo样激酶(plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类维生素d植物生物碱、小抑制性核糖核酸(sirna)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂、低甲基化剂、检查点抑制剂、肽疫苗等、来自肿瘤抗原的表位或新表位以及这些药剂的一种或多种的组合。

24、在一个方面中，抗体或其抗原结合片段、药物组合物、分离的核酸分子或分离的核酸分子组、载体或者宿主细胞，其用作药物用于预防或治疗癌症。优选地，其中所述癌症选自以下：表达pd-1和/或pd-l1的血液系统恶性肿瘤或实体瘤，如选自以下的癌症：淋巴造血肿瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病，由病毒诱发或与免疫缺陷相关的癌症，如选自以下的癌症：卡波西氏肉瘤(例如，与卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关的)；宫颈癌、肛门癌、阴茎癌和外阴鳞状细胞癌和口咽癌(例如，与人乳头瘤病毒相关的)；b细胞非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)，包括弥漫性大b细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、hhv-8原发性渗出性淋巴瘤、经典霍奇金氏淋巴瘤和淋巴增生性病症(例如，与爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)和/或卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关的)；肝细胞癌(例如，与乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒相关的)；梅克尔细胞癌(例如，与梅克尔细胞多瘤病毒(mpv)相关的)；和与人免疫缺陷病毒感染(hiv)相关的癌症；以及选自以下的癌症：转移性或非转移性、黑色素瘤、恶性间皮瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、头颈癌、尿道上皮癌、结直肠癌、肝细胞癌、小细胞肺癌、转移性梅克尔细胞癌、胃癌或食道癌和宫颈癌。

25、在一个特别的方面中，抗体或其抗原结合片段、药物组合物、分离的核酸分子或分离的核酸分子组、载体或者宿主细胞，其用于治疗癌症，其中肿瘤细胞是pd-l1阴性的。优选地，抗体或其抗原结合片段、药物组合物、分离的核酸分子或分离的核酸分子组、载体或者宿主细胞用作药物用于预防或治疗感染性疾病，优选地慢性感染性疾病，甚至更优选地由选自以下的病毒引起感染性疾病：hiv、肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、htlv病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、jc病毒和虫媒脑炎病毒。

26、在一个特别的方面中，抗体或其抗原结合片段、药物组合物、分离的核酸分子或分离的核酸分子组、载体或者宿主细胞用于治疗患有淋巴细胞减少症的患者。

27、在一个特别的方面中，抗体或其抗原结合片段、药物组合物、分离的核酸分子或分离的核酸分子组、载体或者宿主细胞用作药物用于治疗免疫抑制、免疫功能不全或免疫功能低下的受试者。在另一个特定的方面，所述受试者具有高突变负荷和新抗原密度。