一种用于人或动物的核酸快速提取试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及核酸提取领域，特别涉及一种用于人或动物的核酸快速提取试剂盒及其应用。


背景技术：

2.随着分子生物学技术的发展，精准治疗越来越走近人们的视线。在临床实践中，精准医疗追求针对每个病人正确选择和精确应用适宜的诊疗方法，实现医源性损害最小化、医疗耗费最低化以及病患获益最大化。精准治疗建立在分子诊断的基础上，而核酸提取在分子诊断的过程中占据着非常重要的地位。
3.目前用于核酸提取的方法主要有：溶液提取法、磁珠法和过柱法三种。
4.溶液型抽提是比较经典的提取方法，几乎都含有去污剂(如sds)和盐(如tris、edta、nacl等)的作用，除了提供一个合适的裂解环境，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏的抑制剂(如edta)、维持核酸结构的稳定的试剂(如nacl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
5.磁珠法提取核酸的原理是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，从样本中分离出dna和rna。
6.过柱法提取核酸是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，其基本原理是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。再把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。
7.这些方法不仅操作复杂、成本高而且因多重操作使得大量的核酸流失，最高提取效率只能达到30-40％。因此，目前急需要一种高效快速而且有不影响pcr扩增效率的核酸提取方法用于分子诊断。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种用于人或动物的核酸快速提取试剂盒及其应用，不仅提取成本低、操作简单、耗时短、提取产物不影响pcr扩增，而且因为操作过程中不会引入核酸流失的步骤，提取效率也特别高。
9.为实现以上目的，本发明提供一种用于人或动物的核酸快速提取试剂盒，包括：sds，所述sds加入待测样品后的终体积为0.5％。
10.另外，本方案提供该核酸快速提取试剂盒的应用方法，包括步骤：
11.向待测样本中添加终体积的0.5％的sds后涡旋震荡并瞬时离心；
12.在90℃下加热一段时间后充分离心得到上清液，所述上清液含有核酸。
13.在一些实施例中，所述待测样本为人或者动物的血液样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本、组织液样本、组织样本、培养的细胞系样本和石蜡组织样本。
14.在一些实施例中，所述核酸包括dna和/或rna。
15.具体的，在一些实施例中，涡旋震荡30s后瞬间离心。
16.在一些具体实施例中，90℃水浴或金属浴加热6min后在12000xg下离线2min。
17.本方案在提取人或动物的核酸样本时仅需要sds和depc水，不需要其他额外的试剂使得整体的提取成本极低，且操作也十分简单，仅需在90℃下加热6分钟后再在12000g下离心2分钟即可。另外，本方案还可用于任何形式的人或动物样本的dna和rna提取，提取效率极高。
18.相较现有技术，本技术方案具有以下的特点和有益效果：
19.本技术人通过摸索合适的sds浓度使其可在不需要添加其他表面活性剂的前提下就可以使得核酸释放彻底，剩余的微量sds可以和溶液中的有机物形成沉淀，加上高温使蛋白变性，使得通过离心以后溶液中就留下微量的无机盐离子和水溶性核酸，使得sds释放出来的核酸不需要经过磁珠或者过柱纯化就可以直接用于核酸检测。
20.需要说明的是，本方案在提取人或动物的血液样本中的核酸时不需要经过核酸纯化。传统的核酸提取过程中都需要加入较多的酒精进行清洗，而本方案通过sds省去了酒精清洗的步骤，使得本方案的未经纯化的核酸不仅对正常pcr扩增没有影响，也不会对液滴数字pcr造成影响。
21.具体的，本技术方案通过添加合适剂量的sds进行核酸释放并加热的方式，使得细胞在破裂释放出核酸的过程中大量的蛋白变性，sds和有机分子结合，进而使得在离心过程中与绝大部分有机分子一起进入沉淀，只有水溶性的物质如核酸和无机盐离子留在上清中。因无额外盐离子的加入，整体环境中只有细胞裂解时释放出的小部分盐离子，因此上清中也不会有特别高的盐离子浓度；所以，在pcr扩增过程中不会因盐离子或有机分子的浓度较高影响扩增，反而因为操作步骤少使得核酸流失量低，大大的提高核酸的回收率，本方案的核酸回收率可高达90％。因此，该方法不仅成本低，每人份只需2-3毛钱、操作简单、耗时短，不超过10分钟、提取产物不影响pcr扩增，而且因为操作过程中不会引入核酸流失的步骤，提取效率也特别高。
附图说明
22.图1为本发明实施例中用于提取血液样本的dna的结果示意图。
23.图2为本发明实施例中用于提取血液样本的rna的结果示意图。
24.图3是本发明实施例的不同sds终浓度的提取效率的示意图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1：血液样本dna提取效率的验证。
27.本试验中涉及到的仪器设备：ep管，移液枪，1ml、200μl、10μl的移液枪枪头，离心机，金属浴/水浴锅(90℃加热)。
28.以同时取的同一位患者的外周血的同一批次全血为样本进行检测：
29.实验组：
30.配制好质量体积比为10％的sds母液备用；取100μl的全血样本加入到1.5ml无核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min；取上清(备用)。
31.对照组：
32.平行取同一样本的2份100μl的全血样本加入到1.5ml无核酶的ep管中，分别使用市面上买的凯杰的磁珠法和过柱法全血核酸提取试剂盒，按照使用说明书提取核酸。
33.核酸测定：
34.将实验组和对照组得到的核酸分别使用做其他试剂盒筛选的人的klf2、dusp3和gbp5三个基因的引物探针配制的体系做qpcr，根据taq酶的使用说明书，依据以下条件进行扩增：95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40。
35.检测结果如下表1：
36.表一血液中dna测定结果
[0037][0038]
从图中可以看到：经过对对应基因的检测ct值和扩增曲线的最高荧光强度分析，结果显示：该提取方法提取人血液样本dna对pcr扩增并无影响，因提取效率更高，3个基因的检测ct值均小于过柱法和磁珠法提取的样本对应的检测ct值。说明该提取方法提取血液样本的dna不仅不影响pcr扩增，而且提取效率远高于过柱法和磁珠法。
[0039]
实施例2：：血液样本rna提取效率的验证
[0040]
本试验中涉及到的仪器设备：ep管，离心机，奥盛的金属浴(90℃加热)。
[0041]
以同时取的同一位患者的外周血的同一批次全血为样本进行检测：
[0042]
实验组：
[0043]
配制好质量体积比为10％的sds母液备用；取100μl的全血样本加入到1.5ml无核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min(具体操作如图2所示)；取上清(备用)。
[0044]
对照组：
[0045]
平行取同一样本的2份100μl的全血样本加入到1.5ml无核酶的ep管中，分别使用市面上买的凯杰的磁珠法和过柱法全血核酸提取试剂盒，按照使用说明书提取核酸。
[0046]
rna检测：
[0047]
本方案的对照组和试验组分别使用做其他试剂盒筛选的人的klf2、dusp3和gbp5
三个基因的引物探针和3个不同厂家的一步法逆转录酶配制的9体系做qpcr，其中一步法逆转录酶包括诺唯赞的q225、q227和全式金的aq322等，根据逆转录酶的使用说明书，按以下程序扩增：
[0048]
55℃5min；95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
45。
[0049]
检测结果如下表2：
[0050]
表2血液中rna测定结果
[0051][0052]
如表2所示，经过对对应基因的检测ct值和扩增曲线的最高荧光强度分析，结果显示：该提取方法提取的rna对pcr扩增并无影响，因提取效率更高，3个基因使用3种逆转录酶配制的9种体系的检测ct值均小于过柱法和磁珠法提取的样本对应的检测ct值。说明该提取方法提取血液样本的rna不仅不影响pcr扩增，而且提取效率远高于过柱法和磁珠法。
[0053]
实施例3：痰液样本dna提取效率的验证
[0054]
本试验中涉及到的仪器设备：ep管，离心机，奥盛的金属浴(90℃加热)。
[0055]
以同时取的同一位患者的外周血的同一批次痰液为样本进行检测：
[0056]
实验组：
[0057]
配制好质量体积比为10％的sds母液备用；痰液液化处理后取1ml放入1.5ml无核酶的ep管中，12000xg离心2min弃上清留沉淀后，向沉淀中加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min；取上清(备用)。
[0058]
对照组：平行取同一样本的2份1ml的痰液样本加入到1.5ml无核酶的ep管中，分别使用市面上买的某品牌的磁珠法和过柱法的试剂盒，按照使用说明书提取核酸。
[0059]
测定：分别使用做其他试剂盒筛选的人的klf2、dusp3和gbp5三个基因的引物探针配制的体系做qpcr，根据taq酶的使用说明书，按以下程序扩增：
[0060]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0061]
检测结果如下表3：
[0062]
表三痰液样本的dna测定结果
[0063][0064]
从结果可以看到：该提取方法提取痰液样本的dna不仅不影响pcr扩增，而且提取效率远高于过柱法和磁珠法。
[0065]
实施例4：肺泡灌洗液样本dna提取效率的验证
[0066]
本试验中涉及到的仪器设备：ep管，离心机，奥盛的金属浴(90℃加热)。
[0067]
以以同一位患者同时取的同一批次肺泡灌洗液样本为样本进行检测：
[0068]
实验组：
[0069]
配制好质量体积比为10％的sds母液备用；取肺泡灌洗液样本2ml，12000xg离心2min弃上清，向沉淀中加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min；取上清(备用)。
[0070]
对照组：
[0071]
平行取同一样本的2份2ml的肺泡灌洗液样本加入到2ml无核酶的ep管中，分别使用市面上买的某品牌的磁珠法和过柱法的试剂盒，按照使用说明书提取核酸：
[0072]
测定：分别使用做其他试剂盒筛选的人的klf2、dusp3和gbp5三个基因的引物探针配制的体系做qpcr，根据taq酶的使用说明书，按以下程序扩增：
[0073]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0074]
检测结果如下表4：
[0075]
表四肺泡灌洗液样本的dna测定结果
[0076][0077]
从结果可以看到：该提取方法提取肺泡灌洗液样本的dna不仅不影响pcr扩增，而且提取效率远高于过柱法和磁珠法。
[0078]
实施例5：培养的细胞系样本dna提取效率的验证
[0079]
本试验中涉及到的仪器设备：ep管，离心机，奥盛的金属浴(90℃加热)。
[0080]
以同一批次培养皿培养的细胞系为样本进行检测：
[0081]
实验组：
[0082]
配制好质量体积比为10％的sds母液备用；取长满的6cm的培养皿培养的细胞系：a549,293和k562各一皿，胰蛋白酶消化分散后弃上清，加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min；取上清(备用)。
[0083]
对照组：
[0084]
平行取同同时铺板长满的6cm的培养皿培养的细胞系：a549,293和k562各一皿，胰蛋白酶消化分散后，分别使用市面上买的某品牌的磁珠法和过柱法的试剂盒，按照使用说明书提取核酸：
[0085]
测定：分别使用做其他试剂盒筛选的人的klf2、dusp3和gbp5三个基因的引物探针配制的体系做qpcr，根据taq酶的使用说明书，按以下程序扩增：
[0086]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0087]
检测结果如下表5：
[0088]
表五培养的细胞系样本的dna测定结果
[0089][0090][0091]
从结果可以看到：该提取方法提取细胞系样本的dna不仅不影响pcr扩增，而且提取效率远高于过柱法和磁珠法。
[0092]
实施例6：小鼠组织样本dna提取效率的验证
[0093]
本试验中涉及到的仪器设备：ep管，离心机，奥盛的金属浴(90℃加热)。
[0094]
以小鼠的同一批次的肝脏组织样本为样本进行检测：
[0095]
实验组：
[0096]
配制好质量体积比为10％的sds母液备用；取一片新鲜的小鼠肝脏样本，用手术剪剪碎，使用组织匀浆仪50hz匀浆30秒两次，均分成3等分，一份放入到1.5ml无核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min；取上清(备用)。
[0097]
对照组：
[0098]
另外两份加入到1.5ml无核酶的ep管中，分别使用市面上买的某品牌的磁珠法和过柱法的试剂盒，按照使用说明书提取核酸：
[0099]
测定：分别使用的小鼠的trp53、tlr2和tlr4三个基因的引物探针配制的体系做qpcr，根据taq酶的使用说明书，按以下程序扩增：
[0100]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0101]
检测结果如下表6：
[0102]
表六小鼠组织样本的dna测定结果
[0103][0104]
从结果可以看到：该提取方法提取小鼠组织样本的dna不仅不影响pcr扩增，而且提取效率远高于过柱和磁珠法。
[0105]
实施例7：石蜡样本dna提取效率的验证：
[0106]
本试验中涉及到的仪器设备：ep管，离心机，奥盛的金属浴(90℃加热)。
[0107]
以非小细胞肺癌患者的同一批次的石蜡切片样本样本进行检测：
[0108]
实验组：
[0109]
配制好质量体积比为10％的sds母液备用；取5片非小细胞肺癌患者的石蜡切片样本，刮到1.5ml无核酶的ep管中脱蜡后使用pbs清洗3次，放入56℃的烘箱里10分钟使脱蜡的有机溶剂完全挥发，加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min；取上清(备用)。
[0110]
对照组：
[0111]
平行取两份5片非小细胞肺癌患者的石蜡切片样本，刮到1.5ml无核酶的ep管中脱蜡后使用pbs清洗3次，放入56℃的烘箱里10分钟使脱蜡的有机溶剂完全挥发，分别使用市面上买的某品牌的磁珠法和过柱法的试剂盒，按照使用说明书提取核酸：
[0112]
测定：分别使用做其他试剂盒筛选的人的klf2、dusp3和gbp5三个基因的引物探针配制的体系做qpcr，根据taq酶的使用说明书，按以下程序扩增：
[0113]
95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40；
[0114]
检测结果如下表7：
[0115]
表七石蜡样本的dna测定结果
[0116][0117]
从结果可以看到：该提取方法提取提取非小细胞肺癌石蜡组织样本的dna不仅不影响pcr扩增，而且提取效率远高于过柱法和磁珠法。
[0118]
实施例8不同浓度的sds对dna提取效率的验证：
[0119]
本试验中涉及到的仪器设备：ep管，离心机，奥盛的金属浴(90℃加热)。
[0120]
以同时取的同一位患者的外周血的同一批次全血为样本进行检测：
[0121]
实验组：
[0122]
配制好质量体积比为10％的sds母液备用；取100μl的全血样本加入到1.5ml无核酶的ep管中后加入100μl的depc水，再通过计算加入终浓度为0.5％的sds，涡旋震荡30s，瞬时离心；90℃金属浴加热6mim；12000xg离心2min；取上清(备用)。
[0123]
对照组：其他条件同于实验组，不同之处在于：对照组1中加入终浓度为0.1％的sds,对照组2中加入终浓度为0.2％的sds，对照组3中加入终浓度为0.3％的sds,对照组4中加入终浓度为0.4％的sds,对照组5中加入终浓度为0.6％的sds,对照组6中加入终浓度为0.8％的sds,对照组7中加入终浓度为1％的sds,对照组8中加入终浓度为1.5％的sds。
[0124]
核酸测定：
[0125]
将实验组和对照组得到的核酸分别使用做其他试剂盒筛选的人的klf2、dusp3和gbp5三个基因的引物探针配制的体系做qpcr，根据taq酶的使用说明书，依据以下条件进行扩增：95℃5min，(95℃15s，60℃30s)
×
40,得到不同sds浓度下的血液dna提取效率，如表9所示：
[0126][0127][0128]
将不同浓度的血液dna提取效率以浓度为x轴，提取效率为y轴绘制曲线得到如图3所示的图，因为我们的提取未经纯化过程，sds浓度较高会导致酶变性，所以在sds浓度较高时无扩增曲线。sds％的终浓度控制在0.5％时的提取效率是最佳的。
[0129]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。