鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法与流程

1.本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法。


背景技术：

2.我国传统的优质肉鸡消费是以活鸡为主，消费者主要通过鸡的羽色外貌、胫色、冠的发育等外观特征来判断肉的品质，对鸡屠宰后的皮肤的屠体外观性状关注不高。近年来受疫情影响，优质肉鸡冰鲜上市成为国家主要推行的肉鸡销售模式。冷鲜上市后，肉鸡的皮肤颜色、毛囊密度和直径大小、均一性等性状将直接影响消费者的购买意愿。禽类皮肤毛囊性状将成为育种工作者重点关注和加强选择的性状，毛囊是羽毛生长的控制中心，解析调控鸡羽毛毛囊生长发育的调控机制，对优化和提高鸡屠体外观，进一步研究毛囊对鸟类羽毛发育及颜色外观等的影响，具有重要的科学和生产价值。
3.毛囊原基的发生发育起源于胚胎期表皮和真皮的相互作用，周围的宏观环境和本身的微观环境都在其中发挥着重要作用。毛囊是皮肤的附属器官，结构复杂，目前缺乏关于禽类毛囊相关细胞如毛乳头细胞，外根鞘等细胞培养的技术。单纯通过在表皮细胞或真皮成纤维细胞中进行基因功能等研究，细胞分离难度较大，且不能真实的反应体内的状态。因此通过在体外培养皮肤毛囊组织中进行基因功能等相关研究，能更真实模拟和反映胚体内的状态，研究结果更加可靠。


技术实现要素：

4.为克服相关技术中存在的问题，本公开提供一种鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法。
5.根据本公开的实施例，提供一种鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法，所述方法包括：(1)从胚胎颈部取出孵化至第8天-11天的鸡胚，并用磷酸缓冲盐溶液清洗所述鸡胚；(2)在装有磷酸缓冲盐溶液的培养皿中分离所述鸡胚的背部皮肤组织，并用磷酸缓冲盐溶液清洗被分离的所述背部皮肤组织；(3)将所述被分离的所述背部皮肤放入培养基中，并在38℃-39.5℃、5％ co2的条件下培养7-11天。
6.在一实施例中，所述从胚胎颈部取出孵化至第8-11天的鸡胚，包括：在孵化室通过照蛋挑选包括发育良好的孵化第8-11天的鸡胚的鸡蛋作为种蛋，并用75％酒精消毒液对所述种蛋表面进行清洗消毒并晾干；将消毒晾干后的所述种蛋用紫外线照射20分钟-40分钟。
7.在一实施例中，所述磷酸缓冲盐溶液清洗所述鸡胚，包括：用无菌器械敲碎所述种蛋的蛋壳，用另一无菌器械夹取所述鸡胚，将所述鸡胚放入冰预冷的磷酸缓冲盐溶液中清洗所述鸡胚。
8.在一实施例中，所述将所述鸡胚放入冰预冷的磷酸缓冲盐溶液中清洗所述鸡胚，包括：将所述鸡胚放入含有冰预冷的磷酸缓冲盐溶液的烧杯中，用无菌的所述预冷的磷酸缓冲盐溶液清洗所述鸡胚三次。
9.在一实施例中，所述在装有磷酸缓冲盐溶液的培养皿中分离所述鸡胚的背部皮肤
组织，包括：将所述鸡胚从所述烧杯中取出，放入装有磷酸缓冲盐溶液的所述培养皿中，用无菌器械取所述鸡胚的颅底至尾部的至少部分背部皮肤组织。
10.在一实施例中，所述将所述被分离的所述背部皮肤组织放入培养基中，包括：将所述被分离的所述背部皮肤组织放入六孔板中，并在所述六孔板中加入所述培养基，使得所述背部皮肤组织处于所述培养基液体和气体的交界处。
11.在一实施例中，所述在所述六孔板中加入所述培养基，包括：在所述六孔板中的每个孔中添加1-5ml所述培养基。
12.在一实施例中，所述在38℃-39.5℃、5％co2的条件下培养7-11天，包括：在38℃-39.5℃、5％co2的条件下培养7-11天，其中，每两天更换一次所述培养基液体。
13.在一实施例中，所述在38℃-39.5℃、5％co2的条件下培养7-11天，包括：在38℃-39.5℃、5％co2的条件下培养9天。
14.在一实施例中，所述培养基为在dmem高糖培养基中添加加2-10％胎牛血清和1％青霉素链霉素溶液的培养基。
15.本公开的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：根据本公开提供的方法，所培养出的皮肤毛囊组织生长活力良好，能够更加客观的反映鸡胚体内皮肤和毛囊组织的生长状态。
16.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
17.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
18.图1是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养1天后的毛囊形态。
19.图2是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养2天后的羽芽形态。
20.图3是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养3天后的羽芽形态。
21.图4是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养6天后的羽毛形态。
22.图5是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养9天后的羽毛形态。
23.图6是根据另一示例性实施例示出的一种9胚龄的鸡胚背部皮肤培养0天的羽毛原基。
24.图7是根据另一示例性实施例示出的一种9胚龄的鸡胚背部皮肤培养2天后的羽芽形态。
25.图8是根据另一示例性实施例示出的一种9胚龄的鸡胚背部皮肤培养4天后的羽毛形态。
具体实施方式
26.这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的装置和方法的例子。
27.下面将参考若干示例性实施方式来描述本公开的原理和精神。应当理解，给出这些实施方式仅仅是为了使本领域技术人员能够更好地理解进而实现本公开，而并非以任何方式限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
28.下述实施例中，如非特别说明，所用试剂和材料均为常规市售可得。
29.实施例1：鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法
30.1.收集种蛋，将种蛋消毒后放入孵化箱孵化，孵化至第8天时，在孵化室通过照蛋挑选具有发育良好的鸡胚的种蛋，并用75％酒精消毒液对种蛋表面进行清洗消毒，去除种蛋表面的污物。
31.待种蛋晾干后，用紫外线照射30分钟，转移至超净工作台。
32.以下步骤均在无菌环境中进行：
33.2.取鸡胚并对鸡胚继续清洗：用无菌解剖刀刀柄或者其他器械敲碎钝端蛋壳，换一无菌镊子轻夹胚胎颈部取出鸡胚放置准备好的冰预冷的pbs(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffered saline，简称pbs)烧杯中并轻轻洗涤去胚胎上的液体和杂质，无菌预冷pbs一般洗涤三次。
34.3.分离背部皮肤组织：将鸡胚从烧杯中取出，放入装有pbs的培养皿内，用无菌弯镊小心的取颅底到尾部的背部皮肤，放入pbs中进行清洗，去除血块，脂肪等组织。
35.4.配制培养基：dmem高糖培养基添加10％胎牛血清，1％青霉素链霉素溶液。
36.5.取六孔板，每个孔中添加2ml培养基。
37.6.皮肤毛囊组织培养：将清洗后的鸡胚背部皮肤组织，放入已经添加培养基的六孔板中，使皮肤处于培养基液体和气体面交界处，在39.5℃、5％co2的培养箱中培养。
38.7.培养过程中，每两天换一次培养基液体，可以连续培养9天。
39.实施例1结果：
40.图1是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养1天后的毛囊形态。图2是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养2天后的羽芽形态。图3是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养3天后的羽芽形态。图4是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养6天后的羽毛形态。图5是根据一示例性实施例示出的一种8胚龄的鸡胚背部皮肤培养9天后的羽毛形态。
41.如图1所示，8胚龄培养的皮肤，培养1天后，可以看到皮肤表面有少数完整的羽毛毛囊突起。如图2所示，培养至第2天，毛囊内的羽芽继续生长，向外突起。如图3所示，培养至第3天，羽芽进一步生长变长，可见从毛囊长出的长芽。如图4所示，培养至第6天，羽毛毛干颜色加深。如图5所示，之后羽毛形态与第6天无明显差异，并持续至第9天。
42.实施例2：鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法
43.本实施例提供了一种鸡胚体外皮肤组织培养方法，具体制备方法与实施例1相同，
不同仅在于，所用鸡胚为9胚龄的鸡胚，所用培养基dmem高糖培养基添加8％胎牛血清的培养基，皮肤毛囊组织是在39℃、5％co2的培养箱中培养。
44.实施例2结果：
45.图6是根据另一示例性实施例示出的一种9胚龄的鸡胚背部皮肤培养0天的羽毛原基。图7是根据另一示例性实施例示出的一种9胚龄的鸡胚背部皮肤培养2天后的羽芽形态。图8是根据另一示例性实施例示出的一种9胚龄的鸡胚背部皮肤培养4天后的羽毛形态。
46.如图6所示，9胚龄的皮肤刚从鸡胚组织分离出来在培养基中分离当天可以看到皮肤表面有明显的毛囊原基。如图7所示，培养2天后，毛囊明显向外突出，长出羽芽。如图8所示，培养至第4天时，羽芽进一步生长发育为长芽。培养至第6天时，羽毛毛干颜色加深，变细。
47.实施例3：鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法
48.本实施例提供了一种鸡胚体外皮肤组织培养方法，具体制备方法与实施例1相同，不同仅在于，所用鸡胚为11胚龄的鸡胚，所用培养基dmem高糖培养基添加2％胎牛血清的培养基，皮肤毛囊组织是在38℃、5％co2的培养箱中培养。
49.实施例3结果：
50.11胚龄的皮肤刚从鸡胚组织分离出来在培养基中的形态,可以看到皮肤表面有明显的羽芽。培养1天后，皮肤表面长出的羽芽进一步生长变长。培养至第6天时，羽毛毛干颜色加深，变细。
51.本公开提供的鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法，经多次实验，8至11胚龄的鸡胚背部皮肤毛囊组织进行体外培养培养的成功率较高，几乎是100％成功率。
52.本公开提供的鸡胚皮肤毛囊组织体外培养的方法，操作简单，无需借助酶消化法分离获取细胞或组织。所有培养基为常用培养基，不需要添加鸡胚提取物，无需额外购买生长因子等相关试剂。培养的皮肤毛囊组织生长活力良好，能够更加客观的反映鸡胚体内皮肤和毛囊组织的生长状态。
53.并且，在本公开提供的方法中，采用六孔板对背部皮肤组织进行培养，每个孔培养一个鸡胚的皮肤组织，每个六孔板可以培养六个。六个孔可以进行相同环境的相同操作，生长一致性更好，便于后续的基因功能实验验证。
54.本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本公开的其它实施方案。本技术旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
55.应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限制。