一种现场鉴定糙海参性别的环介导等温扩增的检测引物组、方法和试剂盒

1.本发明涉及性别鉴定分子生物学技术领域，具体涉及一种现场鉴定糙海参性别的环介导等温扩增的检测引物组、方法和和试剂盒。


背景技术：

2.糙海参(holothuria scabra)，俗名明玉参、沙参、白参，隶属于棘皮动物门、海参纲、楯手目、海参科、海参属，因其营养价值高、生长迅速、耐高温等特点，是我国南方发展海参养殖的主要对象。但因过度捕捞等人为因素的影响，近年来糙海参的野生种群数量锐减，并于2010年被列入《国际自然保护联盟濒危物种红色名录》。因此对糙海参采取人工繁育的工作，是恢复糙海参种群数量的一种有效手段。在人工育种工作中，过多的精子会引起多精入卵造成胚胎停止发育；过少的精子则无法高效获得受精卵，因此精子与卵子的比例是育种工作中的关键。然而控制好精卵比的前提条件是将雄雌亲本在排精产卵前进行有效的区分并分开饲养。但糙海参在形态结构上并无显著的性别二态性特征，故无法从外观上准确的判断出糙海参的性别。因此，开发一种简单、快速并且可应用与养殖场的鉴定糙海参性别的方法是十分必要的。
3.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)技术是2000年，notomi等开发的一种恒温核酸扩增方法。其主要特点是，lamp引物设计主要针对靶基因或片段的6个不同区域，设计4-6条特异性引物，从而加速了核酸在反应中的合成速度。dna模板在链置换型dna聚合酶(bst dna polymerase)的作用下，于65℃恒温条件下扩增30-60min，便可以合成大量的核酸，具有操作简便、快速、精确、低价、结果可肉眼判断等优势。将lamp 技术与糙海参雄性特异性序列结合在一起，发明一种操作简单、快速、便捷的方法，判断糙海参的雌雄性别是一种合理的方式。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种操作方便简单、无需昂贵的仪器设备的快速鉴定糙海参性别的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。
5.本发明利用环介导等温扩增技术，以糙海参雄性特异性片段为目标序列，设计、筛选并优化四条特异性引物，建立一种lamp检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性 (雄性)对照组和阴性(雌性)对照组，并通过钙黄绿素显色法和琼脂糖凝胶电泳分析检测样品组和其他两组对照的扩增产物来判断糙海参样品的性别，以达到简单方便，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本发明的目的。
6.本发明的第一个目的是提供的一种现场鉴定糙海参性别的环介导等温扩增检测引物组，所述的引物组包含一条前外引物f3(hsm-f3)、一条前内引物fip(hsm-fip)、一条后内引物bip(hsm-bip)和一条后外引物b3(hsm-b3)，序列如下：
7.hsm-f3：5
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gaagatcaccatttattgggt-3’；
8.hsm-fip：5
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ggaaatgttgatttcaccatttggtcagtcacaaagtgaat cagg-3’；
9.hsm-bip：5
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agatgaggaagagtgctgtgaatcttcaatggatgggaac tt-3’；
10.hsm-b3：5
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acctaagacatgttgctga-3’。
11.本发明的第二个目的是提供上述的检测引物组在制备现场鉴定糙海参性别的环介导等温扩增检测试剂盒中的应用。
12.本发明的第三个目的是提供一种现场鉴定糙海参性别的环介导等温扩增检测试剂盒，其包含环介导等温扩增反应液、bst dna聚合酶、mncl2溶液、钙黄绿素显色液、阳性(雄性) 对照质控品、阴性(雌性)对照质控品和上述的检测引物组。
13.优选的，所述的阳性对照质控品为含糙海参雄性特异性片段的雄性基因组dna，通过从糙海参雄性个体基因组dna或通过人工合成获得。
14.优选的，所述的阴性对照质控品为不含糙海参雄性特异性片段的雌性基因组dna或 ddh2o，通过从糙海参雌性个体基因组dna或超纯水获得。
15.本发明的第四个目的是提供一种现场鉴定糙海参性别的环介导等温扩增检测方法，其包括以下步骤：取待测糙海参个体的五触手组织，提取基因组dna；以基因组dna为模板，采用上述的检测试剂盒对基因组dna进行环介导等温扩增；将扩增产物通过钙黄绿素显色法或琼脂糖凝胶电泳分析判断糙海参样品的性别。
16.优选的，所述的通过钙黄绿素荧光显色法分析判断糙海参样品的性别具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则该样品为雄性糙海参；若扩增产物颜色为橙黄色，则该样品为雌性糙海参。
17.优选的，所述的通过琼脂糖凝胶电泳分析判断糙海参样品的性别具体为：将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳条带为梯状条带，则该样品为雄性糙海参；若电泳条带无梯状条带，则该样品为雌性糙海参。
18.优选的，所述的环介导等温扩增反应体系为：2
×
lamp master mix 12.5μl，40μm前内引物hsm-fip 1μl，40μm后内引物hsm-bip 1μl，10μm前外引物hsm-f3 0.5μl，10μm 后外引物hsm-b3 0.5μl，dna polymerase 0.5μl，10mmol/l甜菜碱3μl，10mmol/l mncl2溶液2μl，0.5mmol/l钙黄绿素2μl，dna模板1μl，ddh2o 1μl，总体系25μl。
19.优选的，所述的环介导等温扩增反应条件为：65℃反应60min，80℃反应10min。
20.本发明的第五个目的是提供上述的检测引物组、上述的检测试剂盒或上述的检测方法在现场鉴定糙海参性别中的应用。
21.本发明根据糙海参雄性特异性片段为目标序列设计特异性引物组，具有很好的特异性，可用于鉴定糙海参的雄雌性别。本发明设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该引物组的检测试剂盒以及使用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待测糙海参样品的性别。本发明的检测引物组，检测试剂盒和检测方法具有特异性强，操作方便简单，检测时间短，无需昂贵的仪器设备等优势没特别适合在养殖现场进行检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
22.图1为糙海参性腺及五触手组织样品lamp扩增产物的显色分析结果图。1.雄性样品1 的性腺组织；2.雄性样品2的性腺组织；3.雄性样品1的五触手组织；4.雄性样品2的五
触手组织；5.雌性样品1的性腺组织；6.雌性样品2的性腺组织；7.雌性样品1的五触手组织；8. 雌性样品2的五触手组织；其中1，2，3，4为亮绿色，5，6，7，8为橙黄色。
23.图2为糙海参性腺及五触手组织样品lamp扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。m.标准分子量dl2000；1.雄性样品1的性腺组织；2.雄性样品2的性腺组织；3.雄性样品1的五触手组织；4.雄性样品2的五触手组织；5.雌性样品1的性腺组织；6.雌性样品2的性腺组织7. 雌性样品1的五触手组织；8.雌性样品2的五触手组织。
24.图3为30头未知性别的糙海参五触手组织样品lamp扩增产物的显色分析结果图。
25.图4为30头未知性别的糙海参五触手组织样品lamp扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
26.以下实施是对本发明的进一步说明，并非对本发明的限制。
27.实施例1
28.选取体重600-800g的糙海参5头，经解剖后发现其中3头为雄性个体、2头为雌性个体。从中分别挑选2头雄性和雌性个体，分别获取其性腺及五触手组织样品。其中，2头雄性个体的性腺组织分别记为样品1和样品2，五触手组织分别记为样品3和样品4，2头雌性个体的性腺组织分别记为样品5和样品6，五触手组织分别记为样品7和样品8。通过海洋动物基因组dna提取试剂盒(tiangen)提取基因组dna，以本发明提供的糙海参雄性特异性序列的环介导等温扩增检测的引物hsm-f3：5
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gaagatcaccatttattgggt-3’；hsm-fip：5
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g gaaatgttgatttcaccatttggtcagtcacaaagtgaatcagg-3’；hsm-bip：5
’‑
agatg aggaagagtgctgtgaatcttcaatggatgggaactt-3’和hsm-b3：5
’‑
acctaagaca tgt tgctga-3’对待测基因组dna进行环介导等温扩增。反应体系为：2
×
lamp master mix 12.5μl，前内引物hsm-fip(40μm)1μl，后内引物hsm-bip(40μm)1μl，前外引物hsm-f3 (10μm)0.5μl，后外引物hsm-b3(10μm)0.5μl，dna polymerase 0.5μl，甜菜碱(10mmol/l) 3μl，mncl2溶液(10mmol/l)2μl，钙黄绿素(0.5mmol/l)2μl，dna模板1μl，ddh2o 1μl，总体系25μl。反应条件为：65℃反应60min，80℃反应10min。待反应结束后，可视化肉眼观察。雄性个体的样品1，2，3，4扩增产物颜色为亮绿色；雌性个体的样品5，6，7， 8扩增产物颜色为橙黄色(图1)。随后对每个扩增产物取10μl，点样于1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，135v通电25min，电泳分析检测结果显示，雄性个体的样品1，2，3，4电泳条带呈梯状条带；雌性个体的样品5，6，7，8电泳无特异性条带(图2)。
29.实施例2
30.选取性别未知、体重600-800g的糙海参30头并将其标号每个个体剪取少量的五触手组织。通过海洋动物基因组dna提取试剂盒(tiangen)提取基因组dna，以本发明提供的糙海参雄性特异性序列的环介导等温扩增检测的引物hsm-f3：5
’‑
gaagatcaccatttattgg gt-3’；hsm-fip：5
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ggaaatgttgatttcaccatttggtcagtcacaaagtgaatcagg-3’； hsm-bip：5
’‑
agatgaggaagagtgctgtgaatcttcaatggatgggaactt-3’和hsm-b3： 5
’‑
acct aagacatgttgctga-3’对待测基因组dna进行环介导等温扩增。反应体系为： 2
×
lamp master mix 12.5μl，前内引物hsm-fip(40μm)1μl，后内引物hsm-bip(40μm)1 μl，前外引物hsm-f3(10μm)0.5μl，后外引物hsm-b3(10μm)0.5μl，dna polymerase 0.5 μl，甜菜碱
(10mmol/l)3μl，mncl2溶液(10mmol/l)2μl，钙黄绿素(0.5mmol/l)2μl， dna模板1μl，ddh2o 1μl，总体系25μl。反应条件为：65℃反应60min，80℃反应10 min。待反应结束后，可视化肉眼观察。15个dna样品的扩增产物为亮绿色，提示其可能来源于雄性糙海参；15个dna样品的扩增产物为橙黄色，提示其可能来源于雌性糙海参(图 3)。随后对扩增产物取10μl，点样于1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，135v通电25min，电泳分析检测结果显示，15个dna样品的扩增产物电泳条带呈梯状条带，提示其可能来源于雄性糙海参；15个dna样品的扩增产物电泳无特异性条带，提示其可能来源于雌性糙海参(图4)。
31.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。