LncRNAgadd7对HALI中肺泡II型上皮细胞影响的研究方法及应用

本发明涉及生物医学，尤其涉及lncrna gadd7对hali中肺泡ii型上皮细胞影响的研究方法及应用。

背景技术：

1、机械通气和氧疗被广泛用于管理和治疗危重新生儿的新生儿急症。然而，长时间暴露在高浓度氧气中会导致新生儿支气管肺发育不良和慢性肺部疾病；其主要病理特征是肺泡发育紊乱或停滞，表现为肺泡数量减少、肺泡结构简化、体积增大和肺间质纤维化等。高氧性急性肺损伤(hali)是氧疗典型的并发症，可引起急性呼吸窘迫综合征，严重影响早产儿的生活质量。

2、在hali中，高氧可导致肺泡上皮细胞(aec)坏死和凋亡。肺泡表面覆盖着两种功能和形态不同的细胞，即i型aec(aec i)和ii型aec(aec ii)，其中aec ii循环回收、合成和分泌肺表面活性物质，并维持肺泡液体的稳态；aec ii细胞是高氧肺损伤的主要靶点。减少aec ii的凋亡是抑制hali的重要途径。据报道，线粒体功能障碍可导致了高氧诱导小鼠的肺泡发育停滞。高氧可通过调节线粒体功能诱导血管内皮细胞凋亡。线粒体融合受不同蛋白质的调节，包括mitofusin 1(mfn1)和mitofusin-2。mir-20b通过靶向mfn1和mfn2抑制线粒体功能障碍介导的凋亡，从而抑制hali。进一步研究aecii凋亡调控途径和线粒体功能调控通路可能为hali的防治提供新的策略。

3、长链非编码rna(lncrna)是超过200个核苷酸的非编码rna，是各种生物合成过程中的重要调节因子。lncrna nef通过foxa2(叉头框蛋白a2)调节hali的肺上皮细胞。lncrnacasc2(rna癌易感性候选基因2)通过竞争性结合mirna-194-5p来抑制hali，从而靶向cavi(评价动脉硬化的独立指标)。lncrna gadd7是一种754-nt的多腺苷酸化lncrna，它是从中国仓鼠卵巢细胞中分离出来的。胍丁胺通过抑制lncrna gadd7的表达来抑制hali。然而，lncrna gadd7是否通过mfn1影响haliaecs的线粒体膜电位(mmp)和凋亡仍不清楚。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供lncrna gadd7对hali中肺泡ii型上皮细胞影响的研究方法及应用，通过lncrna gadd7在线粒体膜电位mmp和高氧性急性肺损伤中肺泡ii型上皮细胞凋亡中的作用机制研究，为hali的防治提供策略。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、lncrna gadd7对hali中肺泡ii型上皮细胞影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，

4、s1：将标准大鼠的肺泡ii型上皮细胞进行分组转染和培养；

5、s2：分别从步骤s1中培养后的各组肺泡ii型上皮细胞中提取总rna，并逆转录成cdna；

6、s3：使用蛋白质印迹法确定步骤s1中培养后的各组细胞中目标蛋白的相对水平；

7、s4：使用基质金属蛋白酶法确定步骤s1中培养后的各组细胞中线粒体膜电位的相对含量变化；

8、s5：使用流式细胞术检测步骤s1中培养后的各组细胞凋亡情况；

9、s6：对步骤s2-s5中的结果进行统计分析。

10、进一步的，步骤s1中将标准大鼠的肺泡ii型上皮细胞系分为8组进行转染和培养，具体为：常氧组、高氧组、高氧+sh-nc转染组、高氧+sh-lncrnagadd7转染组、高氧+oe-nc转染组、高氧+oe-lncrnagadd7转染组、高氧+sh-lncrnagadd7转染+oe-nc转染组、高氧+sh-lncrnagadd7转染+oe-mfn1转染组。

11、进一步的，常氧培养的细胞培养环境为21％o2、74％氮气和5％co2；高氧培养的细胞培养环境为95％o2和5％co2，培养时间为24h。

12、进一步的，标准大鼠的肺泡ii型上皮细胞系的培养基为：含有10％胎牛血清和1％100u/ml青霉素/100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基。

13、进一步的，步骤s2的具体操作包括以下步骤，

14、s201：使用trizol试剂从步骤s1中培养后的各组肺泡ii型上皮细胞中提取总rna，rna样品的浓度和纯度用光谱法测定；

15、s202：用特异性taqman rt引物和prime scriptii第一链cdna合成试剂盒合成互补dna；逆转录的反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性15秒的40个循环，以及在60℃延伸1分钟；

16、s203：使用2-δδct方法计算由内部参数标准化的lncrna gadd7和mfn1的相对表达水平。

17、进一步的，步骤s3的具体操作包括以下步骤，

18、s301：在常氧和高氧培养后，裂解细胞样品以提取总蛋白质，并测定蛋白质浓度；

19、s302：通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳制备每组样品中的30μg蛋白质，并转移到聚偏氟乙烯膜上；

20、s303：用含有tween-20的tris缓冲盐水制备5％脱脂奶，将聚偏氟乙烯膜置于5％脱脂奶中，摇匀，在室温下封闭1小时以阻断非特异性结合，并分别与抗mfn1、抗bax、抗bcl-2在4℃下放置一夜；

21、s304：使用增强化学发光工作溶液对步骤s303中得到的样品进行显影并成像，检测蛋白质条带密度。

22、进一步的，步骤s4的具体操作包括以下步骤，

23、s401：将步骤s1中每组处理后的细胞与jc-1染色工作溶液在37℃下在黑暗中孵育20分钟；

24、s402：使用荧光显微镜观察样品并成像；

25、s403：分析红色和绿色荧光的平均荧光强度，红色/绿色荧光强度的比值代表mmp，比值的降低代表mmp的降低。

26、进一步的，步骤s5的具体操作包括以下步骤，

27、s501：在常氧和高氧培养后，将肺泡ii型上皮细胞重悬于培养基中，在4℃下以400×g离心5分钟，并去除上清液；

28、s502：将步骤s501处理后的细胞重悬于1ml冷磷酸盐缓冲盐水中，并在4℃下以400×g离心5分钟，去除上清液；

29、s503：用含有10μl膜联蛋白v-fitc和10μl碘化丙锭染料的pbs缓冲液重悬细胞；温和混合后，将细胞在4℃黑暗中孵育30分钟，用pbs洗涤；

30、s504：使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

31、进一步的，lncrna gadd7在高氧性急性肺损伤防治药物中的应用。

32、进一步的，lncrna gadd7通过mfn1促进高氧性急性肺损伤中肺泡ii型上皮细胞线粒体膜电位下降和凋亡，从而起到对高氧性急性肺损伤防治的作用。

33、本发明的有益效果是：

34、本发明公开了lncrna gadd7对hali中肺泡ii型上皮细胞影响的研究方法，分析研究了lncrna gadd7对hali线粒体膜电位(mmp)与肺泡ii型上皮细胞(aec ii)凋亡的影响。rle-6tn(大鼠肺泡ii型细胞)在常氧或高氧条件下培养24小时，并分别用sh-lncrnagadd7、oe-lncrnagadd7、sh-lncrnagadd7和oe-mfn1质粒转染；通过rt-qpcr(实时荧光定量)和westernblot(蛋白质印迹法)评估lncrnagadd7水平和mfn1水平；rle-6tn细胞用jc-1(线粒体膜电位荧光探针)染色，用荧光显微镜观察mmp的变化，记录红色/绿色荧光强度的比率；通过流式细胞仪检测细胞凋亡；最终得出：lncrna gadd7和mfn1在高氧诱导的aec ii中高表达；高氧诱导rle-6tn细胞mmp降低，凋亡增加，bax水平上调，bcl-2降低；lncrna gadd7正向调节mfn1表达；lncrnagadd7的降低抑制了高氧诱导的rle-6tn细胞mmp降低和凋亡；mfn1过表达消除了lncrnagadd7沉默对rle-6tn细胞mmp下降和凋亡的抑制作用；也即，lncrnagadd7通过正向调节hali中mfn1的表达来促进mmp减少和aec ii的凋亡。本发明通过lncrna gadd7在线粒体膜电位mmp和高氧性急性肺损伤中肺泡ii型上皮细胞凋亡中的作用机制研究，为hali的防治提供策略。