一种碳链延长酶BFD变体及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种碳链延长酶bfd变体及其应用。

背景技术：

1、一碳化合物是非常有应用前景的绿色能源物质得到广泛关注，可以用来合成基本的有机化工原料、燃料和其他高附加值化学品。因其廉价易得的特性，一碳化合物成为替代石油制备高价值化合物最有发展前景的化合物，在医药、食品、化工领域具有重要的科学意义和开发价值。同时一碳化合物的利用和转化也可以显著减少人们在化石燃料利用和合成材料使用过程中对生态环境造成的负面影响。

2、甲醛能够由其他一碳化合物转化而来，进而转化为生物利用的中间物质，同时又兼具来源广泛、价格低廉等特点，在工业生物技术中具有广泛的应用前景。虽然，通过改造微生物来利用一碳化合物已有成功的例子，但是甲醛、甲醇等一碳化合物并不能作为唯一碳源提供微生物的生长，另外，通过微生物代谢利用甲醇合成高价值化合物的产量很低，而且副产物很多。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种碳链延长酶bfd变体及其应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种甲醛转化蛋白变体(即碳链延长酶bfd变体)。

3、本发明要求保护的甲醛转化蛋白变体为将原始甲醛转化蛋白进行点突变后所得；所述原始甲醛转化蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述甲醛转化蛋白变体的氨基酸序列与seq id no.1相比，在第460、463和/或467位具有点突变。

4、进一步地，所述甲醛转化蛋白变体的氨基酸序列与seq id no.1相比，具有或仅具有如下(a1)-(a3)任一所示突变：

5、(a1)单突变：m460e、m460l、m460t、r463a、r463c、r463d、r463e、r463h、r463k、r463l、r463n、r463q、r463s、r463w、v467a、v467d、v467e、v467i、v467l、v467m、v467q或v467r；

6、(a2)双突变：m460l+r463c、m460l+r463s、m460l+v467e、m460t+r463h、r463a+v467l、r463c+v467l、r463d+v467l、r463e+v467r、r463h+v467l、r463k+v467e、r463l+v467d、r463l+v467e、r463q+v467l、r463q+v467m、r463s+v467a、r463s+v467e、r463w+v467i或r463w+v467r；

7、(a3)三突变：m460e+r463a+v467l、m460e+r463d+v467l、m460e+r463q+v467l、m460l+r463a+v467l、m460l+r463d+v467i、m460l+r463d+v467l、m460l+r463h+v467a、m460l+r463l+v467a、m460l+r463l+v467d、m460l+r463q+v467l、m460l+r463s+v467l或m460t+r463d+v467l。

8、对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置(即在seq id no.1中的位置)，取代氨基酸。相应地，在seq id no.1的第460位用谷氨酸取代原有的蛋氨酸命名为“m460e”。多个突变通过加号(+)分开，例“m460l+r463c”代表在位置460和位置463处的蛋氨酸(m)和精氨酸(r)分别被亮氨酸(l)和半胱氨酸(c)取代。

9、第二方面，本发明要求保护一种核酸分子。

10、本发明要求保护的核酸分子为编码第一方面中所述甲醛转化蛋白变体的核酸分子。

11、进一步地，编码所述原始甲醛转化蛋白(seq id no.1)的核酸分子如seq id no.2所示。

12、更进一步地，编码所述甲醛转化蛋白变体的核酸分子与seq id no.2相比，具有或仅具有如下(b1)-(b3)任一所示突变：

13、(b1)atg1378gag、atg1378ctg、atg1378act、cgg1387gcg、cgg1387tgt、cgg1387gat、cgg1387gag、cgg1387cat、cgg1387aag、cgg1387ctg、cgg1387aat、cgg1387cag、cgg1387tct、cgg1387tgg、gtt1399gcg、gtt1399gat、gtt1399gag、gtt1399att、gtt1399ctg、gtt1399atg、gtt1399cag、gtt1399agg；

14、(b2)atg1378ctt+cgg1387tgt、atg1378ctg+cgg1387agt、atg1378ctg+gtt1399gag、atg1378acg+cgg1387cat、cgg1387gct+gtt1399ctt、cgg1387tgt+gtt1399ctt、cgg1387gat+gtt1399ctg、cgg1387gag+gtt1399agg、cgg1387cat+gtt1399ctt、cgg1387aag+gtt1399gag、cgg1387ctg+gtt1399gat、cgg1387ctt+gtt1399gag、cgg1387cag+gtt1399ctg、cgg1387cag+gtt1399atg、cgg1387agt+gtt1399gcg、cgg1387agt+gtt1399gag、cgg1387tgg+gtt1399att、cgg1387tgg+gtt1399agg；

15、(b3)atg1378gag+cgg1387gct+gtt1399ctt、atg1378gag+cgg1387gat+gtt1399ctg、atg1378gag+cgg1387cag+gtt1399ctg、atg1378ctg+cgg1387gct+gtt1399ctt、atg1378ctg+cgg1387gat+gtt1399att、atg1378ctg+cgg1387gat+gtt1399ctg、atg1378ctg+cgg1387cat+gtt1399gcg、atg1378ctt+cgg1387ttg+gtt1399gct、atg1378ctg+cgg1387ttg+gtt1399gat、atg1378ttg+cgg1387cag+gtt1399ctt、atg1378ttg+cgg1387tcg+gtt1399ttg、atg1378act+cgg1387gat+gtt1399ctg。

16、对于核苷酸取代，使用下述命名法：原始密码子，位置(即在seq id no.2中的起始位置)，取代密码子。相应地，在seq id no.2的第1378-1380位用gag取代原有的atg命名为“atg1378gag”。多个密码子突变通过加号(+)分开，例“atg1378ctt+cgg1387tgt”代表在seqid no.2的第1378-1380位和第1387-1389位处的atg和cgg分别被ctt和tgt取代。

17、第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌或转基因细胞系。

18、其中，所述表达盒可由所述核酸分子和启动所述核酸分子转录的启动子以及转录终止序列组成。所述重组载体可为含有所述表达盒的重组载体。所述重组菌可为含有所述重组载体的重组菌。所述转基因细胞系可为含有所述重组载体的非动物或植物来源的转基因细胞系。

19、第四方面，本发明要求保护前文第一方面所述的甲醛转化蛋白变体在如下任一中的应用：

20、(c1)生产1,3-二羟基丙酮和/或羟基乙醛；

21、(c2)提高1,3-二羟基丙酮和/或羟基乙醛产量；

22、(c3)通过生产1,3-二羟基丙酮来制备其下游产物；

23、(c4)生产糖类、有机酸或氨基酸。

24、第五方面，本发明要求保护前文第二方面所述核酸分子或前文第三方面所述的表达盒、重组载体或重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

25、(d1)制备用于生产1,3-二羟基丙酮和/或羟基乙醛的产品；

26、(d2)制备用于提高1,3-二羟基丙酮和/或羟基乙醛产量的产品；

27、(d3)制备用于通过生产1,3-二羟基丙酮来制备其下游产物的产品；

28、(d4)制备用于生产糖类、有机酸或氨基酸的产品。

29、第六方面，本发明要求保护一种生产1,3-二羟基丙酮和/或羟基乙醛的方法。

30、本发明要求保护的生产1,3-二羟基丙酮和/或羟基乙醛的方法，可包括如下步骤：在受体菌中引入前文第二方面中所述核酸分子，得到重组菌；对所述重组菌进行培养使其表达前文第一方面中所述甲醛转化蛋白变体，将含有所述甲醛转化蛋白变体的表达产物与含有甲醛的溶液反应获得1,3-二羟基丙酮和/或羟基乙醛。

31、第七方面，本发明要求保护一种通过生产1,3-二羟基丙酮来制备其下游产物的方法。

32、本发明要求保护的通过生产1,3-二羟基丙酮来制备其下游产物的方法，可包括如下步骤：在受体菌中引入前文第二方面中所述核酸分子，得到重组菌；对所述重组菌进行培养使其表达前文第一方面中所述甲醛转化蛋白变体，将含有所述甲醛转化蛋白变体的表达产物与含有甲醛的溶液反应获得1,3-二羟基丙酮，进一步可以制备下游产物。

33、在本发明的具体实施方式中，所述核酸分子是以重组在的形式导入所述受体菌中的。所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子为t7启动子。所述重组载体具体为将所述核酸分子插入到pet28a载体的多克隆位点后得到的重组载体。

34、在第六方面和第七方面中，所述受体菌可为大肠杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述受体菌为大肠杆菌bl21 gold(de3)。

35、在第六方面和第七方面中，所述培养为将所述重组菌接入lb培养基，在37℃200rpm摇床中培养至od600达到0.6时加入iptg使培养液中iptg终浓度为0.1mm，再调整温度为30℃培养诱导表达24h。

36、在第六方面和第七方面中，所述将含有所述甲醛转化蛋白变体的表达产物与含有甲醛的溶液反应具体为：将培养后的所述重组菌超声破碎后的上清液与甲醛和tpp反应。进一步地为：向所述上清液中加入甲醛和tpp至甲醛终浓度为20mm，tpp浓度为1mm；所述反应具体可为30℃反应3h。更进一步地，在将所述上清液与甲醛和tpp反应后还可包括向反应体系中加入工具酶buffer1(配方：0.6mg/ml半乳糖氧化酶，32u/ml辣根过氧化物酶，ph 7.4)和buffer2(配方：8mm abts，ph 7.4)的步骤，其中，含有所述上清液与甲醛和tpp和反应体系、所述buffer1和所述buffer2的体积比为90μl：60μl：50μl。

37、本发明通过分析甲醛转化蛋白(fls)的pdb结构，发现α螺旋与相邻残基组成了底物产物进出通道，并通过计算分析手段确定了其能够发生构象变化并影响催化效率。本发明选择该α螺旋上第460、463、467位三个侧链伸向通道的重要氨基酸残基进行饱和突变，获得该酶的突变体大大提高了甲醛缩合产生1,3-二羟基丙酮的效率。