一种RNA检测系统及其用途的制作方法

本发明属于核酸检测，涉及一种rna检测系统及其用途，更具体涉及一种双核酸酶辅助的等温循环放大的一体化检测系统和及其检测rna的用途，以及基于该检测系统的rna检测方法。

背景技术：

1、核糖核酸(ribonucleic acid，rna)是一种广泛存在于生物细胞及部分病毒中的遗传信息载体。rna具备多种表现形式，包括基因组rna、信使rna、转移rna、核糖体rna和一系列非编码rna(如mirnas)，都在生命的进程中发挥着各自重要的作用。例如mirnas参与调控一系列细胞功能，包括细胞增殖、分化、死亡，同时mirnas也被证实可通过致癌和抑癌的双向功能参与多种实体瘤细胞通路的调控。

2、然而，由于mirna具备片段较短、序列相似性强、表达差异跨度大、样本背景复杂等特点，使其高灵敏、高特异性的定量分析困难重重。现有的mirna检测技术包括传统的northern blotting和高通量测序，但都需要复杂的实验操作，且灵敏度较低、样本消耗量大、检测周期长。而qrt-pcr核酸检测平台在核酸扩增技术的参与下，具有较好的检测灵敏度。但由于其过程涉及核酸的逆转录和扩增等步骤，可能会引入一些潜在的问题，包括额外的实验操作、扩增偏差、靶标分子遗失、气溶胶污染造成的假阳性风险等。而目前新兴的基于基因芯片的mirna定量检测方法也由于其标记和修饰技术的复杂性，在应用场景上受到了较大的限制。

3、此外，以cas13a为代表的crispr效应核酸酶为mirna的体外检测提供了新的方向。在crrna的介导下，cas13a可特异性地识别待测样本中的目标rna片段，并激活其核酸外切酶活性，进而对荧光报告探针进行切割，导致荧光信号的增强，借助荧光信号即可实现对目标片段的检测。然而现有的crispr cas13a核酸检测平台仍具有明显的局限性，在不借助核酸扩增技术的基础上，其检测限通常只能达到pm级，难以满足现有临床诊断中对mirna的检测需求。(anal.chem.,2022,94(27):9826–9834.anal.chem.,2019,91(8):5278-5285.biosens.bioelectron.,2021,178,113027.)建立一种针对mirna等短链核酸片段的，无需借助常规核酸扩增技术的高灵敏度体外检测新方法具有迫切的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有rna检测技术存在的不足，提供一个高灵敏度、高特异性的，无需核酸扩增的一体化rna定量检测系统及其用途。

2、该检测系统采用双核酸酶辅助的等温循环放大的一体化检测技术检测rna，其以crispr cas13a系统作为起始反应，用于识别待测样本中的靶标rna，并借助其反式切割活性进行初步的信号放大和转导；以基于聚多巴胺纳米微球的psdna循环放大技术代替常规cas13a核酸检测体系所必须的核酸扩增技术，实现信号的进一步放大和转导。通过上述设计，可将起始反应和循环放大反应在单一反应腔体内进行集成，既革除了对核酸扩增技术的依赖，又保证了检测的灵敏度和特异性。

3、具体地，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

4、本发明的第一方面提供一种rna检测系统，包含如下两个单元：

5、单元一：cas13a-crrna复合物对待测样本中的靶标rna进行识别，并激活cas13a核酸酶的反式切割活性；cas13a核酸酶切割blocker rna-psdna复合物中的blocker rna链，释放psdna，参与单元二的反应；

6、单元二：psdna竞争结合被聚多巴胺纳米微球保护的dna荧光探针，形成psdna-探针复合物，实现荧光信号的增强；dnaseⅰ核酸酶选择性水解psdna-探针复合物中的dna荧光探针，实现荧光信号的进一步增强；释放的psdna进行循环反应。

7、所述的循环反应是指：dnaseⅰ核酸酶选择性水解psdna-探针复合物中的dna荧光探针后，释放出的psdna进一步竞争结合被聚多巴胺纳米微球保护的dna荧光探针，形成psdna-探针复合物，dnaseⅰ核酸酶选择性水解psdna-探针复合物中的dna荧光探针，释放psdna，从而实现psdna的循环参与单元二的反应。

8、所述的cas13a-crrna复合物是指：cas13a核酸酶和crrna结合所形成的复合物。

9、所述的靶标rna是指：利用cas13a-crrna复合物所识别的rna序列。

10、所述的blocker rna-psdna复合物是指：blocker rna和psdna互补结合所形成的复合物，是cas13a核酸酶的切割底物。

11、所述的psdna是指：磷酸二脂键的磷原子被硫代修饰的dna。

12、所述的blocker rna是指：与psdna部分互补的rna，用于封闭psdna，

13、所述的dna荧光探针是指：5’端或3’端标记荧光基团的单链dna。

14、所述的单元一与单元二于两个或同一个反应腔体内进行，更优选再同一反应腔体内进行。

15、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a选自：lwacas13a、lbacas13a、lbucas13a、lshcas13a、lsecas13a、lbncas13a、camcas13a、cgacas13a、pprcas13a、lwecas13a或lbfcas13a，更优选lwacas13a。

16、在本发明一个优选的实施方案中，所述的psdna为硫代修饰，其中“*”表示硫代磷酸二酯键。其核苷酸序列如seq id no.1所示：

17、seq id no.1：5’-t*g*a*g*g*t*a*g*t*t*c*c*a*t*g*t*a*t*a*g*t*t-3’。

18、与天然dna相比，由于所述的psdna的磷酸二脂键结构上的差异，因此所述的psdna可逃逸dnaseⅰ等常见核酸酶的切割。

19、在本发明一个优选的实施方案中，所述的blocker rna-psdna复合物是由blockerrna和psdna经杂交形成，其结构包括：第一互补区：a区，具有a个互补碱基数；第二互补区：b区，具有b个互补碱基数；茎环结构区：n区，具有n个“auc”片段重复数。

20、在本发明一个优选的实施方案中，所述的a≥8，所述的b≥5，所述的n≥5。

21、在本发明一个优选的实施方案中，所述的a＝8，所述的n＝8，所述的b＝6；

22、此时，blocker rna的结构简称为8-8-6(a-n-b)，其核苷酸序列如seq id no.2所示：

23、seq id no.2：

24、5’-aacuauacuaucaucaucaucaucaucaucaucaccuca-3’。

25、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a为lwacas13a，所述的靶标rna为mir-19b，所述为crrna为mir-19b-crrna，所述的mir-19b-crrna的核苷酸序列如seq idno.3所示：

26、seq id no.3：

27、5’-ggggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacucaguuuugcauggauuugcaca-3’。

28、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a为lwacas13a，所述的靶标rna为mir-17，所述为crrna为mir-17-crrna，所述的mir-17-crrna的核苷酸序列如seq id no.4所示：

29、seq id no.4：

30、5’-ggggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuaccugcacuguaagcacuuug-3’；

31、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a为lwacas13a，所述的靶标rna为mir-21，所述为crrna为mir-21-crrna，所述的mir-21-crrna的核苷酸序列如seq id no.5所示：

32、seq id no.5：

33、5’-ggggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacucaguuuugcauggauuugcaca-3’。

34、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a为lwacas13a，所述的靶标rna为mir-155，所述为crrna为mir-155-crrna，所述的mir-155-crrna的核苷酸序列如seq idno.6所示：

35、seq id no.6：

36、5’-ggggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacaccccuaucacgauuagcauuaa-3’。

37、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a为lwacas13a，所述的靶标rna为sars-cov-2，所述为crrna为sgene-crrna，所述的sgene-crrna的核苷酸序列如seq idno.7所示：

38、seq id no.7：

39、5’-ggggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacgcagcaccagcuguccaaccugaagaag-3’。

40、在本发明一个优选的实施方案中，所述的dna荧光探针5’端被fam修饰，其序列如seq id no.8所示：

41、seq id no.8：

42、5’-aactatacatggaactacctca-3’。

43、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a浓度为25-250nm。

44、在本发明一个优选的实施方案中，所述的cas13a与crrna的浓度比为1:1-1:4。

45、在本发明一个优选的实施方案中，所述的dna荧光探针浓度为20-200nm。

46、在本发明一个优选的实施方案中，所述的聚多巴胺纳米微球的浓度为0.05-0.25mg/ml。

47、在本发明一个优选的实施方案中，所述的dnasei核酸酶用量为0.1-1.0u。

48、本发明的第二方面提供了以上任一项所述的rna检测系统在检测靶标rna中的用途；

49、在本发明一个优选的实施方案中，所述的靶标rna选自mir-19b、mir-17、mir-21、mir-155或sars-cov-2。

50、本发明的第三方面提供了一种rna检测方法，所述的rna检测方法基于以上任一项所述的rna检测系统，具体包括以下步骤：

51、(1)cas13a-crrna复合物对待测样本中的靶标rna进行识别，并激活cas13a核酸酶的反式切割活性；cas13a核酸酶切割blocker rna-psdna复合物中的blocker rna链，释放psdna，参与步骤(2)的反应；

52、(2)psdna竞争结合被聚多巴胺纳米微球保护的dna荧光探针，形成psdna-探针复合物，实现荧光信号的增强；dnaseⅰ核酸酶选择性水解psdna-探针复合物中的dna荧光探针，实现荧光信号的进一步增强；释放的psdna进行循环反应。

53、在本发明一个优选的实施方案中，所述的rna检测的反应温度为33-41℃，反应时间为30-120min。