一种联合检测猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒的引物探针组合物及试剂盒的制作方法

本发明涉及核酸检测，具体是涉及一种联合检测猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒的引物探针组合物及试剂盒。

背景技术：

1、正痘病毒属外形为圆角砖型或卵圆形，大小为200nm×250nm，外周为30nm的外膜，环绕均质的核心体。在正痘病毒属中对人类致病的有猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒等。其中天花与猴痘病毒皆可在人群中引起严重皮疹、发热等临床症状，传染力强，是潜在的生物恐怖因子。

2、猴痘是由猴痘病毒（ monkeypox virus，mv）感染所致的一种人兽共患病，之前主要发生在中非和西非。猴痘病毒为猴痘病毒是双链dna病毒，基因组dna全长约197kb。主要通过接触感染动物的呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、其他体液，或被感染动物咬伤、抓伤而感染，还可以通过胎盘由孕妇传播给胎儿。猴痘潜伏期5-21天，多为6-13天。发病早期表现为发热、寒战、头疼、嗜睡、乏力、背部疼痛和肌痛等。90%的患者在颈部、腋窝、腹股沟等部位出现明显的浅表淋巴结肿大。发病后首先在面部出现皮疹，逐渐蔓延至四肢，手心和脚掌均可出现皮疹。

3、牛痘（ cowpox virus，cv）是发生在牛身上的一种传染病，是由牛的天花病毒引起的急性感染，它的症状通常是在母牛的乳房部位出现局部溃疡。该病毒可通过接触传染给人类，多见于挤奶员、屠宰场工人，患者皮肤上出现丘疹，这些丘疹慢慢发展成水疱、脓疱，还会出现一些其他的症状。潜伏期5～7天。在接触部位出现原发性损害，初起为丘疹，很快变成水疱和脓疱，疱中央呈脐凹，周围有红晕及水肿。多发于手指、前臂及面部。可发热，伴局部淋巴结炎及淋巴管炎。

4、天花是由天花病毒（ variola virus，vv）引起的人类烈性传染病，历史上曾多次在全世界范围内流行，给人类带来了深重灾难。目前，天花已在1980宣布被消灭，但是有资料表明，天花生物恐怖袭击和其他相关公共卫生事件仍然在威胁着人类的安全。在天花生物恐怖等相关公共卫生事件发生的时候，快速准确的天花病毒鉴别技术是非常重要的。

5、实时荧光定量pcr技术是在dna扩增反应中引物探针与模板结合，探针的5’端报告基团被taq酶（5’→3’外切核酸酶活性）切断，进而远离淬灭基团，产生荧光信号。荧光定量pcr仪器根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，并计算出样本ct值。

6、目前尚没有能够实现对猴痘病毒、牛痘病毒和天花病毒进行联合检测的引物探针组合物及试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种联合检测猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒的引物探针组合物及试剂盒，并达到以下目的：提高引物探针特异性、检测灵敏度，可同时检测猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒，方便快捷。

2、为实现以上发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、联合检测猴痘病毒、牛痘病毒和天花病毒的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括检测猴痘病毒的上游引物、检测猴痘病毒的下游引物、检测猴痘病毒的荧光探针、检测牛痘病毒的上游引物、检测牛痘病毒的下游引物、检测牛痘病毒的荧光探针、检测天花病毒的上游引物、检测天花病毒的下游引物、检测天花病毒的荧光探针、内参的上游引物、内参的下游引物以及内参的荧光探针。

4、用于检测猴痘病毒的上游引物：5’-cacgaaagacgggatcacaatc-3’，序列记为seqid no:1。

5、用于检测猴痘病毒的下游引物：5’-tgtactcggacgaccactac c-3’，序列记为seqid no:2。

6、用于检测猴痘病毒的荧光探针：5’-tctcagcgaatccatctcaacgtcggaact aacta-3’，序列记为seq id no:3，其中探针5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。

7、用于检测牛痘病毒的上游引物：5’-tggttccttctatcgatcta tcg-3’，序列记为seqid no:4。

8、用于检测牛痘病毒的下游引物：5’-atccacctcctagatatatt acgg-3’，序列记为seq id no:5。

9、用于检测牛痘病毒的荧光探针：5’-cattgtgaacctagactaccgaacctcatc tctga-3’，序列记为seq id no:6，其中探针5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团。

10、用于检测天花病毒的上游引物：5’-tctggagatgaatgcaagac tcac-3’，序列记为seq id no:7。

11、用于检测天花病毒的下游引物：5’-cgtttaagacggggtgtagt tttg-3’，序列记为seq id no:8。

12、用于检测天花病毒的荧光探针：5’-cgctaatatcctctttaataatgtccacac acgcc-3’，序列记为seq id no:9，其中探针5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团。

13、内参上游引物：5’-catggaaagagacattctgt tttc-3’，序列记为seq id no:10。

14、内参下游引物：5’-ataccaagtccaaagaccaa atac-3’，序列记为seq id no:11。

15、内参荧光探针：5’-tgaataagacaaattgtaaatcaaattctc ccc-3’，序列记为seq idno:12，其中探针5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。

16、联合检测猴痘病毒、牛痘病毒和天花病毒的试剂盒，包括pcr反应液、酶混合液、阴性对照品与阳性对照品；所述pcr反应液包括pcr反应buffer、具有如seq id no:1-12所示核苷酸序列的联合检测猴痘病毒、牛痘病毒和天花病毒的引物探针组合物。

17、所述阳性对照品：由猴痘病毒靶标序列的克隆质粒、含有牛痘病毒靶标序列的克隆质粒、含有天花病毒靶标序列的克隆质粒以及含有内参靶标序列的克隆质粒按照1:1:1:1的浓度比混合而成。

18、所述试剂盒的制备方法包括设计引物探针：设计的引物探针的核苷酸序列如seqid no:1-12所示。

19、所述试剂盒的制备方法包括构建反应体系：构建的pcr扩增反应体系为：

20、。

21、所述试剂盒的制备方法包括构建反应体系：反应程序为：第一步：50℃ 2 min，第二步：94℃ 5 min，第三步：95℃ 15 s，第四步：60℃ 30 s，其中第三步与第四步循环40次，在第四步时采集荧光信号。

22、本发明通过特定的反应体系和反应程序，优化了反应体系和反应程序的扩增条件，实现了猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒核酸联合，并达到以下有益效果：

23、（1）本发明分别在猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒的基因高度保守的区域设计引物探针，所设计的引物和探针具有较高的保守性，与其他病原体不存在交叉反应。本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高的特点。

24、（2）试剂盒中的猴痘病毒、天花病毒、牛痘病毒和内参的基因序列特异、4种荧光探针分别使用4种不同的荧光基团标记，各自的荧光信号不会相互干扰，保证了检测的特异性。

25、（3）引入的内参可以监控反应体系中是否存在反应抑制的现象，从而避免了因反应抑制引起的假阴性，因此，可以避免检测结果不准确造成的误诊，显著提高了检测的准确性。

26、（4）该方法操作简单，省时省力，试剂耗材成本较低，可直接对从疑似患者全血、囊泡、脓疱、口咽拭子、鼻咽拭子等样本中提取的核酸进行检测，对检测平台和人工技术的要求较低，能够在常规检测中广泛推广。本发明可同时实现猴痘病毒、天花病毒和牛痘病毒3种病原体的检测，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。pcr后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染。