一种热稳定性提高的蔗糖合酶突变体

本发明涉及一种热稳定性提高的蔗糖合酶突变体，属于酶工程领域。

背景技术：

1、udp-glc存在于植物、动物和微生物中，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，亦可转变为尿苷二磷酸半乳糖和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸。以udp-glc为起点，可在半乳糖差向异构酶的作用下生成尿苷二磷酸半乳糖(udp-gal)，也可以在udp-glc脱氢酶催化下生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(udp-glca)，并进一步在udp-木糖合成酶和udp-木糖差向异构酶作用下分别生成尿苷二磷酸木糖(udp-xyl)和尿苷二磷酸阿拉伯糖(udp-ara)。这些核苷酸糖都是生物体中常见的糖供体，对细胞的生长起到重要的作用，如参与蛋白的糖基化修饰。同时也为合成多寡糖，如人乳寡糖、糖胺聚糖等活性糖类物质提供重要的糖供体。udpg在新型药物和新型甜味剂的开发中也得到应用，例如，udpg作为糖基供体经orf-36-28酶催化合成抗生素be-7585a；以六位碳被标记的14c-udpg作为唯一糖基供体经udp糖基转移酶催化合成甜菊糖的主要糖甙。

2、udp-glc等核苷酸糖类物质均难以从自然界中获取，且价格较为昂贵，因此化学法和酶法成为人工制备udp-糖的常用手段。化学法合成udp-glc通常需要较为严苛的条件(如低温)以及较长的反应时间，时长一般在12小时以上。酶法合成则因为反应条件更为温和绿色，展示出其工业化应用的潜能。

3、udp-glc在生物体途径中的从头合成途径较为复杂，glc经过己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、udp-葡萄糖焦磷酸化酶依次催化后得到udp-glc。蔗糖合酶在微生物和植物中主要参与蔗糖的合成，与植物的光合作用密切相关。蔗糖合酶可催化蔗糖分解为udp-glc和果糖，因其能够实现udp-glc的一步合成催化，得到了广泛的关注。但是蔗糖合酶的热稳定性不强，通常需要在中温条件下(30-45℃)反应10-12h，而这一反应过程大大增加了染菌的风险。因此提高蔗糖合酶的热稳定性，实现在较高温度下的反应，不仅可缩短反应时间，加速udp-glc合成，也降低了染菌的几率。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本发明要解决的技术问题是蔗糖合酶的热稳定性低，通常需要在中温条件下(30-45℃)催化反应。

3、[技术方案]

4、本发明提供热稳定性提高的蔗糖合酶突变体，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列相对于seq id no.1在第g158位、第162位、第240位、第183位、第83位、第612位、第79位、第39位、第100位或第235位是不同的。

5、在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖合酶突变体的亲本来自于nitrosospiraeuropaea。

6、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第158位由甘氨酸突变为色氨酸，命名为g158w。

7、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第162位由谷氨酰胺突变为色氨酸，命名为q162w。

8、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第240位由丝氨酸突变为酪氨酸，命名为s240y。

9、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第183位由谷氨酰胺突变为脯氨酸，命名为q183p。

10、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第83位由丙氨酸突变为脯氨酸，命名为a83p。

11、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第612位由甘氨酸突变为脯氨酸，命名为g612p。

12、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第79位由丙氨酸突变为苯丙氨酸，命名为a79f。

13、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第39位由甘氨酸突变为亮氨酸，命名为g39l。

14、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第100位由丙氨酸突变为脯氨酸，命名为a100p。

15、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第235位由半胱氨酸突变为苏氨酸，命名为c235t。

16、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第162位由谷氨酰胺突变为色氨酸、第612位由甘氨酸突变为脯氨酸、第79位由丙氨酸突变为苯丙氨酸且第240位由丝氨酸突变为酪氨酸。

17、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第162位由谷氨酰胺突变为色氨酸、第612位由甘氨酸突变为脯氨酸。

18、在本发明的一种实施方式中，相对于seq id no.1，所述蔗糖合酶突变体的氨基酸序列在第162位由谷氨酰胺突变为色氨酸、第612位由甘氨酸突变为脯氨酸且第79位由丙氨酸突变为苯丙氨酸。

19、本发明还提供了编码上述突变体的基因。

20、本发明提供了能够表达所述蔗糖合酶突变体的大肠杆菌工程菌。

21、在本发明的一种实施方式中，是以pet 28a(+)为表达载体。

22、在本发明的一种实施方式中，是以escherichia coli bl21为宿主。

23、在本发明的一种实施方式中，制备上述蔗糖合酶突变体的方法的具体步骤：

24、(1)将编码蔗糖合酶突变体的基因连接到表达载体上，得到重组表达载体，

25、(2)将重组表达载体转入宿主，培养宿主，使得宿主表达蔗糖合酶突变体，

26、(3)从宿主培养液中分离纯化出蔗糖合酶突变体。

27、本发明所述热稳定性提高的蔗糖合酶突变体可用于以蔗糖为底物制备udp-glc。例如，以1m蔗糖为底物，加入200mm udp、10mg/l纯化后的蔗糖合酶，在55℃下反应得到udp-glc。

28、[有益效果]

29、本发明通过基因工程手段对蔗糖合酶进行改造，通过单点突变与组合突变得到一系列稳定性提高的转化子，能在高温下实现udp-glc的合成，从而提高生产效率，满足工业化生产的需求。

30、单突变体g158w、q162w、s240y、q183p、a83p、g612p、a79f、g39l、a100p、c235t均表现出高于wt的稳定性，其中，g158w以及q162w在55℃的半衰期分别提高至13min和9min。

31、组合突变体q162w-g612p-a79f-s240y在55℃下孵育30min以上后酶活仍能保持50％，其半衰期较wt提高了27倍。q162w-g612p和q162w-g612p-a79f的半衰期分别为12和15min，相对于wt也明显的提高。

32、应用组合突变体q162w-g612p-a79f-s240y合成udp-glc，反应2h后，q162w-g612p-a79f-s240y催化得到了131mm udp-glc，是wt的5.5倍。同时q162w-g612p-a79f-s240y在55℃条件下快速合成了产物，udp-glc的时空转化率达到37g/l/h，在反应快速的前30min内，其时空转化率高达115g/l/h。实现了在高温下，udp-glc的快速合成。