一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用的制作方法

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用。

背景技术：

1、溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，以及鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁中。溶菌酶又称胞壁质酶或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶，其主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，进而具有抑菌作用。但天然来源的溶菌酶一般活性较低，需要较高的添加量才会具有比较理想的抑菌效果，因此在“替抗”的环境下，寻找或设计安全、抑菌效果好的溶菌酶是亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用。本发明通过筛选获得酶活性提高的溶菌酶突变体lym1、lym2、lym3，其具有抑菌作用，且能够与胆汁酸混合制成新的饲料添加剂，用于水产养殖。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种酶活提高的溶菌酶突变体，所述溶菌酶突变体为溶菌酶突变体lym，其氨基酸序列如seq id no：5所示、或者如seq id no：7所示、或者如seq id no：9所示。

4、进一步的，所述溶菌酶突变体具体为由氨基酸序列为seq id no：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸获得的溶菌酶突变体lym1；由氨基酸序列为seq id no：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸和第130位的甘氨酸变为谷氨酸获得的溶菌酶突变体lym2；由氨基酸序列为seq id no：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸和第154位的天冬酰胺变为天冬氨酸获得的溶菌酶突变体lym3。

5、本发明还提供了一种编码基因，其为所述的溶菌酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no：6所示、或者如seq id no：8所示、或者如seq id no：10所示。

6、本发明还提供了一种重组工程菌，其包含所述的编码基因。

7、本发明还提供了一种胆汁酸酶制剂，其中包含所述的溶菌酶突变体和胆汁酸。

8、进一步的，所述胆汁酸酶制剂是由含溶菌酶突变体的重组工程菌经发酵、过滤、干燥制得的发酵液粉制剂与胆汁酸以2:1～3的质量体积比混合而成的。

9、本发明还提供了所述的溶菌酶突变体在用于制备抑菌剂中的应用。

10、进一步的，所述抑菌剂抑制的致病菌为副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌。

11、进一步的，所述的溶菌酶突变体为溶菌酶突变体lym3。

12、本发明还提供了所述的溶菌酶突变体或者所述的胆汁酸酶制剂在用于制备水产动物的饲料添加剂中的应用。

13、进一步的，所述溶菌酶突变体或胆汁酸酶制剂的用量为50mg/kg日粮～200mg/kg日粮。

14、进一步的，所述水产动物为鲤鱼。

15、与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

16、1、本发明首先将地衣芽孢杆菌来源的溶菌酶进行基因密码子优化，并在c末端添加了6个输水短肽，通过随机突变和筛选获得了酶活性提高的突变体，即分别提供了包含v47a的单点突变体lym1，分别包含v47a/g130e、v47a/n154d的双位点突变体lym2和lym3。本发明改造后的突变体lym1，lym2和lym3和原始融合基因相比，酶活性分别提高了33.5％、56％、81％，且具有很好的抑制副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌等致病菌的作用。

17、2、本发明还利用含溶菌酶突变体的工程菌经发酵、过滤、干燥制得的粉制剂与胆汁酸进行混合，得到的胆汁酸酶制剂可明显提高水产动物的增重率，并明显降低饵料系数，将其用于水产养殖，能够促进水产动物的生长，因此具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种酶活提高的溶菌酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：5所示、或者如seq id no：7所示、或者如seq id no：9所示。

2.根据权利要求1所述的溶菌酶突变体，其特征在于，所述溶菌酶突变体具体为由氨基酸序列为seq id no：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸获得的溶菌酶突变体lym1；由氨基酸序列为seq id no：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸和第130位的甘氨酸变为谷氨酸获得的溶菌酶突变体lym2；由氨基酸序列为seq id no：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸和第154位的天冬酰胺变为天冬氨酸获得的溶菌酶突变体lym3。

3.一种编码基因，其特征在于，其为权利要求1所述的溶菌酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no：6所示、或者如seq id no：8所示、或者如seq id no：10所示。

4.一种重组工程菌，其特征在于，其包含权利要求3所述的编码基因。

5.一种胆汁酸酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸酶制剂中包含权利要求1所述的溶菌酶突变体和胆汁酸。

6.根据权利要求5所述的胆汁酸酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸酶制剂是由含溶菌酶突变体的重组工程菌经发酵、过滤、干燥制得的发酵液粉制剂与胆汁酸以2:1～3的质量体积比混合而成的。

7.权利要求1或2所述的溶菌酶突变体在用于制备抑菌剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂抑制的致病菌为副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌。

9.权利要求1所述的溶菌酶突变体或者权利要求5所述的胆汁酸酶制剂在用于制备水产动物的饲料添加剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述溶菌酶突变体或胆汁酸酶制剂的用量为50mg/kg日粮～200mg/kg日粮。

技术总结
本发明公开了一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用。本发明将来源于地衣芽孢杆菌的溶菌酶基因经过优化后，在C末端融合6个氨基酸的输水短肽，然后进行随机突变，筛选获得酶活性提高的突变体LyM1、LyM2、LyM3，和原始溶菌酶相比，酶活性分别提高了33.5％、56％、81％，其具有很好的抑制致病菌的作用。本发明还利用含溶菌酶突变体的工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与胆汁酸进行混合制得胆汁酸酶制剂，可明显提高水产动物的增重率，并明显降低饵料系数，进而促进水产动物的生长，使其在水产养殖中有良好的应用前景。

技术研发人员：娄倩倩,曹爱智,张西雷,籍立民
受保护的技术使用者：山东龙昌动物保健品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11