出芽短梗霉NCPS2022-M及培养方法

本发明属于微生物，具体涉及一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株及其培养方法和利用该菌株生产普鲁兰多糖的方法。

背景技术：

1、普鲁兰糖是一种由出芽短梗霉(aureobasidium pullulans)分泌的胞外水溶性多糖，是一种线性α-d-葡聚糖，由与α-1，6键连接的麦芽三糖单元组成，而麦芽三糖单元内的葡萄糖残基通过α-1，4-糖苷键连接。普鲁兰多糖中α-1，4和α-1，6糖苷键的共存赋予了普鲁兰多糖独特的物理化学性质，并且具有用于化学修饰的反应位点，使其具有优异的成膜性能、可再生性、无毒性、稳定性、生物相容性、亲水性和降解性，并广泛应用于食品科学，制药，化妆品和生物医学等各个行业。特别是在生物医学研究领域，普鲁兰多糖由于其许多独特的性质，如基因递送，药物递送，组织工程，疫苗接种，分子伴侣，血浆膨胀剂等。然而，普鲁兰多糖昂贵的生产成本严重限制了其在各个行业的应用，随着市场对普鲁兰多糖需求的增加，研究开发具有成本效益的普鲁兰多糖生产方法将成为研发的重点。

2、目前，微生物生物发酵是生产普鲁兰的主要手段，同时还进行了诱变和代谢工程策略来改善普鲁兰的形成。普鲁兰多糖产量高低与所采用的微生物种类密不可分，出芽短梗霉是普鲁兰多糖发酵常用菌种之一，但现有技术的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的产量较低、糖转化率不高的问题，如已经报道的a.melanogenum a4菌株，尽管可以在300g/l麦芽糖发酵培养基中发酵生产普鲁兰糖，但是产量为122.3g/l，转化率只有0.4g/g(chen etal.,2019)，大量的碳源未转化为普鲁兰糖，不利于降低生产成本。

3、因此提供一种高产普鲁兰多糖株，还需要对其培养方法进行探究，以便于使其在培养的过程中提高普鲁兰多糖的产量，促进普鲁兰多糖的工业化生产。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株，还提供了上述菌株的培养方法，以及利用该菌株生产普鲁兰多糖的方法。

2、本发明所提供的出芽短梗霉菌，于2022年08月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no：m 20221272，分类命名为：出芽短梗霉aureobasidium pullulans ncps2022-m。

3、本发明中的出芽短梗霉ncps2022-m，在保藏之前曾以出芽短梗霉m233-20来命名。

4、上述的出芽短梗霉菌，其its dna序列如序列表1所示。

5、上述的出芽短梗霉菌的培养方法，包括以下的步骤：

6、(1)活化菌种：将出芽短梗霉菌接种在种子培养基中，并在26～30℃下以200～240rpm的转速孵育20～28小时；

7、(2)摇瓶发酵培养：将种子培养物转移到含有60～100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，接种量为4～6％，并在26～30℃和200～240rpm的旋转振荡器上培养150～160小时。

8、优选的，(1)中，在28℃下以220rpm的转速孵育24小时。

9、(2)中，所述的发酵培养基为：190～210g/l葡萄糖、5～9g/l豆粕水解物、4～8g/l氯化钾、2～5g/l氯化钠、0.1～0.3g/l硫酸铵、0.05～0.25g/l硫酸镁和10～20g/l食品级轻质caco3。

10、更优选的，(2)中，200g/l葡萄糖、7.01g/l豆粕水解物、6g/l氯化钾、3.44g/l氯化钠、0.18g/l硫酸铵、0.1g/l硫酸镁和16g/l食品级轻质caco3。

11、出芽短梗霉菌的培养方法，包括以下的步骤：

12、(1)活化菌种：将出芽短梗霉菌接种在种子培养基中，并在26～30℃下以200～240rpm的转速孵育20～28小时；

13、(2)发酵罐培养：在发酵罐中加入培养基，取步骤(1)中的活化的菌种，转移到发酵罐中发酵培养，离心，获得含有普鲁兰多糖的上清液；发酵罐培养所采用的培养基为：190～210g/l葡萄糖、5～9g/l豆粕水解物、4～8g/l氯化钾、2～5g/l氯化钠、0.1～0.3g/l硫酸铵、0.05～0.25g/l硫酸镁和10～20g/l食品级轻质caco3。

14、更优选的，发酵罐发酵培养基如下：200g/l葡萄糖、7.01g/l豆粕水解物、6g/l氯化钾、3.44g/l氯化钠、0.18g/l硫酸铵、0.1g/l硫酸镁和16g/l食品级轻质caco3。

15、优选的，(2)发酵培养时，取1l步骤(1)中的活化的菌种，转移到灭菌后的培养基中，在28℃、400rpm下进行发酵培养，并且保持曝气速率为20l/min，168h后取培养物。

16、利用出芽短梗霉菌发酵生产普鲁兰多糖的方法，其步骤是，将经过上述方法获得的培养物在10000rpm和4℃下离心10min，获得含有普鲁兰多糖的上清液，该上清液通过干燥，获得普鲁兰多糖。

17、本发明的有益效果在于：

18、(1)本发明中，经过筛选所获得的突变体出芽短梗霉，其对于高浓度的葡萄糖具有优异的耐受性，可以实现在高浓度葡萄糖的条件下高产普鲁兰多糖；最终实现普鲁兰多糖的产量能达到162g/l以上；

19、(2)本发明的出芽短梗霉发酵所产的普鲁兰多糖，其颜色呈现出米白色，不含黑色素，克服了普通的出芽短梗霉菌所产的普鲁兰多糖产生黑色素致使的产品外观不甚理想的缺陷，从而大大提高了产品的品质，满足了普鲁兰多糖在食品、医药、环境等应用领域对普鲁兰糖颜色的要求。

技术特征：

1.出芽短梗霉菌，于2022年08月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20221272，分类命名为：出芽短梗霉aureobasidium pullulans ncps2022-m。

2.如权利要求1所述的出芽短梗霉菌，其its dna序列如序列表1所示。

3.出芽短梗霉菌的培养方法，包括以下的步骤：

4.如权利要求3所述的出芽短梗霉菌的培养方法，（1）中，在28℃下以220rpm的转速孵育24小时。

5.如权利要求3所述的出芽短梗霉菌的培养方法，（2）中，所述的发酵培养基为：190～210g/l葡萄糖、5～9g/l豆粕水解物、4～8g/l氯化钾、2～5g/l氯化钠、0.1～0.3g/l硫酸铵、0.05～0.25g/l硫酸镁和10～20g/l食品级轻质caco3。

6.如权利要求3所述的出芽短梗霉菌的培养方法，（2）中，所述的发酵培养基为： 200g/l葡萄糖、7.01g/l豆粕水解物、6g/l氯化钾、3.44g/l氯化钠、0.18g/l硫酸铵、0.1g/l硫酸镁和16g/l食品级轻质caco3。

7.出芽短梗霉菌的培养方法，包括以下的步骤：

8.如权利要求7所述的出芽短梗霉菌的培养方法，（2）发酵培养时，取1l步骤（1）中的活化的菌种，转移到灭菌后的培养基中，在28℃、400 rpm下进行发酵培养，并且保持曝气速率为20 l/min，144 h后取培养物。

9.利用出芽短梗霉菌发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，将经过权利要求8所述方法获得的培养物在10000 rpm和4℃下离心10 min，获得含有普鲁兰多糖的上清液。

技术总结
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一株出芽短梗霉，还涉及其培养方法。本发明的出芽短梗霉的分类命名为出芽短梗霉NCPS2022‑M，该菌株已于2022年08月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221272。本发明所提供的出芽短梗霉，是将野生型菌株NCP2016和ARTP诱变产生的突变体92、214、219、221、233和246培养并筛选所获得的。本发明的出芽短梗霉与现有的普鲁兰糖生产菌株相比，普鲁兰多糖的产率更高，极大的提高了原料的利用率、降低了生成成本，并且产品色素含量低，满足了食品、医药、环境等应用领域对普鲁兰糖颜色的要求。

技术研发人员：陈蕾蕾,杨金玉,赵双枝,周庆新,张彦昊,裘纪莹,辛雪,王军华,杨晓宇,姜潇潇,祝清俊
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16