一种融合蛋白HN-RBD、编码基因、重组NDV病毒载体、重组NDV病毒及其应用的制作方法

一种融合蛋白hn-rbd、编码基因、重组ndv病毒载体、重组ndv病毒及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种融合蛋白hn-rbd、编码基因、重组ndv病毒载体、重组ndv病毒及其应用。


背景技术：

2.新冠(sars-cov-2)病毒是一类主要的呼吸道病毒，新冠病毒通过囊膜表面的s蛋白与宿主细胞膜上ace2蛋白相互作用感染人体。因此，针对新冠病毒s蛋白产生高效的抗体是疫苗研发的关键。
3.新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)是一种负链rna病毒，基因组包括np、p、m、f、hn、l六大基因，其中，f蛋白和hn蛋白属于病毒囊膜蛋白，hn蛋白包含胞内结构域，跨膜结构域以及胞外结构域，胞外结构域含有stalk和head两部分。ndv载体可以负载外源基因，以ndv为载体经过反向遗传学的方法产生的重组ndv病毒粒子具有良好的安全性，作为疫苗株产生体液以及细胞免疫以外，还可以产生黏膜免疫，从根源阻止呼吸道类病原体对生物体的感染和在感染部位定殖。
4.重组ndv病毒产生更多的抗原抗体igg以及iga有两大因素，一是重组dnv病毒粒子携带的抗原蛋白基因所表达的抗原蛋白有良好的免疫原构象；二是重组ndv病毒粒子表面能够展示更多的抗原蛋白。如何使得重组ndv病毒粒子表面能够展示更多的抗原蛋白是一直以来悬而未解的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种融合蛋白hn-rbd、编码基因、重组ndv病毒载体、重组ndv病毒及其应用，本发明的方法能够使重组ndv病毒粒子表面展示更多的新冠病毒抗原s蛋白。
6.本发明提供了一种融合蛋白hn-rbd，包含新城疫病毒hn蛋白的部分结构域和新冠病毒s蛋白的rbd；所述新城疫病毒hn蛋白的部分结构域包括新城疫病毒hn蛋白的胞内结构域和跨膜结构域。
7.优选的，所述新城疫病毒hn蛋白的部分结构域还包括新城疫病毒hn蛋白的胞外stalk结构域。
8.优选的，所述新城疫病毒hn蛋白的部分结构域的氨基酸序列如seq id no.1所示或seq id no.2所示。
9.本发明还提供了上述方案所述融合蛋白hn-rbd的编码基因。
10.本发明还提供了上述方案所述的融合蛋白hn-rbd或者所述的编码基因在提高新城疫病毒囊膜粒子表面s蛋白展示量和/或提高重组新城疫病毒产生黏膜免疫抗体iga的能力中的应用。
11.本发明还提供了一种重组ndv病毒载体，以新城疫病毒为原始载体，插入有上述方
案所述的编码基因和新冠病毒s蛋白或新冠s蛋白变体的编码基因；所述新冠s蛋白变体的编码基因指与新冠s蛋白同源性大于90％的蛋白的编码基因；所述新冠s蛋白变体包括s2p、s2p/gsas或s6p；所述s2p是将新冠病毒s蛋白胞外域进行k986p和v987p突变；所述s2p/gsas是在s2p基础上将第682～685位氨基酸rrar突变为gsas；所述s6p是在s2p基础上进行f817p、a892p、a899p和a942p突变。
12.优选的，所述新冠病毒s蛋白或新冠s蛋白变体的编码基因插入在新城疫病毒载体的p基因和m基因之间；所述融合蛋白hn-rbd的编码基因插入在新城疫病毒载体载体的m基因和f基因之间或者插入在新城疫病毒载体载体的p基因和m基因之间。
13.本发明还提供了一种重组ndv病毒，由上述方案所述的重组ndv病毒载体经过病毒反向遗传学拯救获得。
14.本发明还提供了上述方案所述的融合蛋白hn-rbd或者所述的重组ndv病毒载体或者所述的重组ndv病毒在制备预防新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。
15.本发明还提供了一种预防新型冠状病毒感染的疫苗，包含上述方案所述的重组ndv病毒。
16.本发明提供了一种融合蛋白hn-rbd，包含新城疫病毒hn蛋白的部分结构域和新冠病毒s蛋白的rbd；所述新城疫病毒hn蛋白的部分结构域包括新城疫病毒hn蛋白的胞内结构域和跨膜结构域。当本发明的融合蛋白hn-rbd的编码序列与新冠病毒s蛋白或新冠病毒s蛋白变体的编码序列组合共同插入ndv病毒载体中时，可以使得重组ndv病毒粒子表面展示更多的新冠病毒抗原s蛋白，同时提高重组ndv病毒产生黏膜免疫抗体iga的能力，对开发优秀的重组ndv病毒疫苗候选株具有重大意义。
附图说明
17.图1表示western blot检测病毒粒子囊膜新冠病毒s蛋白含量的结果，其中，lane 1：ndv-s2p；lane 2：ndv-s2p/gsas；lane 3：ndv-s2p-minispike；lane 4：ndv-s2p-m-hsa-rbd-fc-f；lane 5：ndv-s2p/hn-rbd；lane 6：ndv-s2p-hn-rbd；lane 7：ndv-s2p/gsas-hn-rbd；lane 8：ndv-s2p-hn-gfp；lane 9：marker；hn是内参蛋白，用以衡量病毒粒子的含量；
18.图2为构建的重组病毒示意图，含有s与hnrbd组合的重组病毒囊膜表面拥有更多s蛋白；
19.图3为elisa检测小鼠鼻洗液和肺泡灌洗液s1 iga结果，*p《0.05；
20.图4为elisa检测灭活重组ndv疫苗免疫小鼠后血清s1 igg抗体，**p《0.05。
具体实施方式
21.本发明提供了一种融合蛋白hn-rbd，包含新城疫病毒hn蛋白的部分结构域和新冠病毒s蛋白的rbd；所述新城疫病毒hn蛋白的部分结构域包括新城疫病毒hn蛋白的胞内结构域和跨膜结构域。
22.在本发明中，所述新城疫病毒hn蛋白的部分结构域优选还包括新城疫病毒hn蛋白的胞外stalk结构域。
23.在本发明中，所述rbd来源于新冠病毒原始株或者变异株的s蛋白。
24.在本发明中，所述新城疫病毒hn蛋白的胞内结构域和跨膜结构域的氨基酸序列如
seq id no.1所示，具体为：mdravsqvalendereakntwrlifriailfltvvtlaisvasll。
25.在本发明中，当所述新城疫病毒hn蛋白的结构域由新城疫病毒hn蛋白的胞内结构域、跨膜结构域和胞外stalk结构域组成时，氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为：
26.mdravsqvalendereakntwrlifriailfltvvtlaisvasllysmgastpsdlvgiptrisraeekitstlgsnqdvvdriykqvalesplallntettimnaitslsyqingaannsg。
27.在本发明中，所述新城疫病毒hn蛋白的结构域的c端通过蛋白linker和新冠病毒s蛋白的rbd的n端连接。本发明对所述蛋白linker的序列没有特殊限制，采用本领域所熟知的蛋白linker即可；所述蛋白linker的氨基酸序列优选为：ggsg(seq id no：3)。
28.本发明还提供了上述方案所述融合蛋白hn-rbd的编码基因。在本发明中，所述融合蛋白hn-rbd的编码基因经过密码子优化。在本发明中，所述编码基因的核苷酸序列优选的如seq id no.4所示，具体为：
29.atggaccgcgccgttagccaagttgcgttagagaatgatgaaagagaggcaaaaaatacatggcgcttgatattccggattgcaatcttattcttaacagtagtgaccttggctatatctgtagcctcccttttatatagcatgggggctagcacacctagcgatcttgtaggcataccgactaggatttccagggcagaagaaaagattacatctacacttggttccaatcaagatgtagtagataggatatataagcaagtggcccttgagtctccgttggcattgttaaatactgagaccacaattatgaacgcaataacatctctctcttatcagattaatggagctgcaaacaacagtggcggcgggagcggcagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattaccggtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcaaaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttaa。
30.本发明还提供了上述方案所述的融合蛋白hn-rbd或者所述的编码基因在提高新城疫病毒囊膜粒子表面s蛋白展示量和/或提高重组新城疫病毒产生黏膜免疫抗体iga的能力中的应用。
31.当本发明的融合蛋白hn-rbd的编码序列与新冠病毒s蛋白或新冠s蛋白变体的的编码序列共同插入ndv病毒载体中时，可以使得重组ndv病毒粒子表面展示更多的新冠病毒抗原s蛋白，同时提高重组ndv病毒产生黏膜免疫抗体iga的能力。
32.本发明还提供了一种重组ndv病毒载体，以新城疫病毒为原始载体，插入有上述方案所述的编码基因和新冠病毒s蛋白或新冠s蛋白变体的编码基因；所述新冠s蛋白变体的编码基因指与新冠s蛋白同源性大于90％的蛋白的编码基因；所述新冠s蛋白变体包括s2p/gsas、s2p或s6p；所述s2p是将新冠病毒s蛋白胞外域进行k986p和v987p突变；所述s2p/gsas是在s2p基础上将第682～685位氨基酸rrar突变为gsas；所述s6p是在s2p基础上进行f817p、a892p、a899p和a942p突变。
33.在本发明实施例中，所述s2p/gsas的氨基酸序列如seq id no.5所示，具体为：atmfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnspgsassvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldppeaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt*，其中s蛋白来源于原始株。
34.在本发明中，所述s2p的氨基酸序列如seq id no.6或seq id no.7所示；seq id no.6所示的s2p来自原始株，具体为：
35.mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldppeaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt*；
36.seq id no.7所示的s2p来自来自delta变异株，具体为：
37.mfvflvllplvssqcvnlrtrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpfldvyyhknnkswmesgvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynyryrlfrksnlkpferdisteiyqagskpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqgvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsrrrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqnvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldppeaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt*。
38.在本发明中，所述新冠病毒s蛋白或新冠s蛋白变体的编码基因优选的插入在新城疫病毒载体的p基因和m基因之间；所述融合蛋白hn-rbd的编码基因优选的插入在新城疫病毒载体的m基因和f基因之间或插入在新城疫病毒载体的p基因和m基因之间；所述编码基因优选的以表达盒子的形式插入。本发明中对所述重组ndv病毒载体的构建方法没有特殊限制，优选的通过同源重组方式克隆至骨架载体中，形成重组病毒载体。
39.本发明还提供了一种重组ndv病毒，由上述方案所述的重组ndv病毒载体经过病毒反向遗传学拯救获得。本发明对所述病毒反向遗传学拯救的方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法即可。
40.本发明还提供了上述方案所述的融合蛋白hn-rbd或者所述的重组ndv病毒载体或者所述的重组ndv病毒在制备预防新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。
41.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
42.实施例1抗原基因设计及合成
43.将新冠病毒s蛋白进行v986p和k987p位氨基酸突变，形成s2p新冠病毒s蛋白变体。在s2p基础上，将新冠r682～r685位氨基酸突变为gsas，形成s2p/gsas新冠病毒s蛋白变体，同时将新冠s2p蛋白的跨膜结构区和胞内结构区删除，融合含ndv f蛋白跨膜结构区和胞内结构区的氨基酸序列，形成s2p/f34新冠病毒s蛋白变体。将新冠病毒s蛋白rbd序列n端通过蛋白linker ggsg(seq id no：3)融合ndv hn蛋白的1～122个氨基酸，形成hn-rbd融合蛋白。
44.将绿色荧光蛋白gfp的n端通过蛋白linker ggsg融合ndv hn基因的1～122个氨基酸，形成hn-gfp融合蛋白。将新冠rbd蛋白n端添加人igg重链分泌信号肽mkhlwfflllvaaprwvls(seq id no.29)，c端通过linker gsg连接狂犬病毒g蛋白的包含跨膜区和胞内区部分，形成minispike融合蛋白。将以上蛋白的编码序列进行密码子优化后，
送金唯智进行基因合成。
45.实施例2重组ndv载体构建
46.本实施例使用了原始株s蛋白的变体和delta株s蛋白的变体序列。以ndv_sars-cov-2_s(公布于专利cn112011521a)重组病毒载体为模板，设计引物将s2p，s2p/gsas，s2p/f34，利用pcr和同源重组的方式克隆进入ndv载体的p基因和m基因之间，代替原来载体中的s基因，分别形成ndv-s2p/f34，ndv-s2p和ndv-s2p/gsas重组病毒载体。以ndv-s2p和ndv-s2p/gsas重组病毒载体为模板，设计引物利用pcr和同源重组的方式将hn-rbd，hn-gfp，minispike分别克隆进上述重组病毒载体的m基因和f基因位置，分别形成ndv-s2p-hn-rbd，ndv-s2p-hn-gfp，ndv-s2p/gsas-hn-rbd和ndv-s2p-minispike重组病毒载体。以ndv-s2p病毒载体为模板，设计引物利用pcr和同源重组的方式将hn-rbd以表达盒子形式插入ndv病毒载体p基因和m基因之间、s2p基因之后，形成ndv-s2p/hn-rbd重组病毒载体。扩增引物见表1，其中，pcr过程按照primer star酶说明书要求对模板进行扩增，同源重组按照hifi dnaassembly试剂盒说明书要求对pcr产物进行重组连接。其中，ndv-s2p/gsas-hn-rbd，ndv-s2p-minispike，ndv-s2p/hn-rbd病毒载体中的s蛋白序列均来自于原始株s蛋白变体；s2p/f34，ndv-s2p-hn-rbd和ndv-s2p-hn-gfp病毒载体中的s蛋白序列均来自于delta株s蛋白变体。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆验证构建无误后，37℃在lb培养基中过夜摇菌并提取质粒。
47.所述s2p/f34的氨基酸序列如seq id no.8所示，具体为：
48.mfvflvllplvssqcvnlrtrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpfldvyyhknnkswmesgvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynyryrlfrksnlkpferdisteiyqagskpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqgvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsrgsassvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqnvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldppeaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqlgnvnnsisnalnkleesnrkldkvnvkltstsalityivltiislvfgilslilacylmykqkaqqktllwlgnntldqmrattkm*。
49.表1
50.[0051][0052]
实施例3重组ndv病毒拯救
[0053]
分别将实施例2的重组新城疫病毒载体，和病毒拯救辅助pci-np，pci-p和pci-l的质粒，经nano drop测定质粒浓度后，转染bhk21-t7细胞。转染方法如下：于6孔板中培养bhk21-t7细胞，待细胞生长至80％～90％时，无菌pbs洗3次；取500μl opti-mem于1.5ml离心管中，随后按照1：1：1：1的比例分别加入含新冠病毒s基因的重组新城疫病毒载体，pci-np，pci-p和pci-l质粒，每管质粒总量为4μg，供1个孔使用；向上述溶液中加入3μlplus reagent，室温作用5min；加入9μl lipofectamine ltx，轻轻混匀；室温作用30min；加入上述转染复合物，再加入2ml opti-mem，37℃二氧化碳培养箱孵育18～48h。
[0054]
转染24h后，加入终浓度为0.5μg/μl的tpck胰酶，待转染72h后，反复冻融细胞3次，并将混合物接种9日龄spf鸡胚，0.5ml/胚。弃去24h内的死胚，收获24～120h内所有死亡和存活的鸡胚尿囊液，逐个测定ha效价。获得的具有ha活性的胚液，并测序验证确保插入位置正确，插入序列没有发生突变；所获得的拯救病毒命名为ndv-s2p/gsas，ndv-s2p，ndv-s2p/hn-rbd，ndv-s2p/gsas-hn-rbd，ndv-s2p-hn-rbd，ndv-s2p-minispike和ndv-s2p-hn-gfp。
[0055]
收获病毒ha效价见表2：
[0056]
表2
[0057]
[0058][0059]
如表2中结果所示，所拯救含有s蛋白或s蛋白变体以及融合蛋白hn-rbd的病毒，ha效价都在7.5以上，一般经过传代适应，病毒效价可显著提高，效价可达到8～11log2。可见，本发明所述方法所产生的重组病毒可满足疫苗实际生产要求。
[0060]
实施例4病毒粒子纯化
[0061]
配置5xpeg8000+nacl溶液，称取nacl 8.766g，peg800050g溶解在200ml milli-q纯水中，121℃30min湿热灭菌30min，保存在4℃备用。使用0.45μm孔径滤头过滤ndv重组病毒上清液，每30ml过滤后的病毒初始液加入5x peg-8000+nacl母液7.5ml，每隔20～30min颠倒混匀一次，混匀3～5次后4℃静置过夜。随后4℃，4000g离心20min，吸弃上清，静置管子1～2min，吸走残余液体，加入适量的opti-mem溶解ndv病毒沉淀，待后续使用。
[0062]
实施例5western blot
[0063]
将纯化好的病毒加入sds上样缓冲液，95℃煮10min，加入到组装好的预制胶孔中，每孔上样量为10μl，蛋白marker上样10μl。80v电泳20min，120v电泳50min后，小心撬开电泳凝胶板，裁取整块胶并放入转膜液10min，按“三明治”的形式从上到下依次摆放1层海绵、2～3张滤纸、分离胶、甲醇处理过的pvdf膜、2～3张滤纸、1层海绵，组装湿转系统，灌满预冷转膜液，没过“三明治”，恒流300ma湿转50～70min。将膜从湿转系统中取出，室温摇床上封闭液封闭20min。0.1％pbst润洗封闭后的膜3次，每次5min，室温1h孵育一抗，0.1％pbst润洗膜3次，每次5min；室温下摇床孵育二抗60min，孵育后0.1％pbst润洗膜3次，每次10min。将ecl发光液a液与b液混合，化学发光仪下曝光拍照。结果见图1。
[0064]
由图1结果可知，在ndv-s2p/hnrbd，ndv-s2p-hnrbd以及ndv-s2p/gsas-hnrbd重组病毒中，相比仅含有s蛋白序列的重组病毒ndv-s2p/gsas和ndv-s2p，以及含有一个s蛋白和一个非hn-rbd融合蛋白序列的ndv-s2p-minispike和ndv-s2p-deltarbd-fc重组病毒，检测到了更多的s蛋白或s蛋白的裂解产物s1的表达(以hn蛋白作为病毒粒子含量的内参)。minispike和deltarbd-fc两种rbd融合蛋白分别代表了rbd表达的两种形式，上膜表达和分泌表达，其中，minispike与hn-rbd同属于膜蛋白表达。由此可见，将s蛋白与rbd融合蛋白编码序列共同插入到ndv病毒中时，只有含有s蛋白和hn-rbd融合蛋白组合的重组病毒，其病毒囊膜表面的s蛋白的展示量相比更高，可见，hn-rbd可以提高s蛋白在病毒囊膜表面的展示量(图2)。并且，这种作用不受hn-rbd插入位点的影响，即插入ndv载体p基因和m基因，或m基因和f基因之间都能起到相同作用。
[0065]
实施例6小鼠免疫及黏膜抗体检测
[0066]
选取ha效价达到7log2以上的毒株尿囊液，对4～5周龄balb\c雌性小鼠进行鼻腔
免疫，免疫方法为：使用5％水合氯醛腹腔注射，剂量为体重每20g小鼠腹腔注射0.1ml使动物麻醉，麻醉后用移液器进行滴鼻免疫，25μl/鼻孔。共进行两次免疫，首免后7天进行二次加强免疫。首免后16天，采集麻醉后小鼠鼻洗液和肺泡灌洗液，根据义翘神州kit007试剂盒说明书要求，检测小鼠黏膜新冠s1 iga抗体含量，将所有获得的od450数据除以空白对照小鼠背景od450值，将数据归一化处理后得到相对s1 iga含量。结果见图3。由结果可知，在鼻洗液中，新冠s1 iga抗体含量没有显著性差异，这可能与鼻黏膜分泌抗体能力较弱有关。在肺泡灌洗液中，含有s蛋白变体与融合蛋白hn-rbd组合的重组病毒刺激黏膜产生新冠s1 iga抗体的能力均有大幅度提升，ndv-s2p/hnrbd,ndv-s2p-hnrbd重组病毒产生的新冠s1 iga抗体相比对照组ndv-s2p/gsas，ndv-s2p-minispike和ndv-s2p-deltarbd-fc有显著差异(*p《0.05)。由此可知，含有s蛋白变体与融合蛋白hn-rbd组合的重组ndv病毒具有产生更高黏膜免疫抗体的能力。
[0067]
实施例7制备灭活重组ndv疫苗并免疫小鼠
[0068]
使用上述重组病毒ndv-s2p/gsas-hnrbd以及ndv-s2p/gsas收获液接种鸡胚，34℃培养72h后收获鸡胚尿囊液，0.1％的甲醛4℃灭活处理后接种10日龄鸡胚，安检确认病毒已经灭活。将灭活病毒与cpg佐剂混合均匀，肌肉注射4～5周龄balb/c雌性小鼠20μl/只，免疫后14天采血获取血清。根据义翘神州新冠病毒sars-cov-2spike s1 antibody titerassay试剂盒试剂说明书要求，将血清样本进行100倍稀释并检测血清s1 igg含量。结果见图4，而相较于ndv-s2p/f34,ndv-s2p/gsas-hn-rbd灭活病毒所产生的抗体od450值相对提高近一倍，即含有s与融合蛋白hn-rbd组合的重组病毒产生了更强劲的血液免疫s1 igg抗体(**p《0.01)。由于病毒经过灭活处理，灭活的重组病毒不再能感染宿主细胞进而表达相应抗原蛋白，所以灭活病毒的免疫原性主要来自于病毒粒子所携带蛋白。结合图1&2结果可知，s1 igg抗体的产生能力主要来自于病毒囊膜粒子表面的s蛋白或s蛋白变体，以及可能存在的微量hn-rbd，由于本实施例中hn-rbd插入在s蛋白变体的下游，其含量不会比s2p/gsas更高，所以hn-rbd产生的s1 igg抗体能力不及s2p/gsas蛋白，故可以推断提高近一倍的s1 igg抗体主要是由病毒囊膜表面更多的s2p/gsas蛋白贡献。进一步说明将hn-rbd与s蛋白或其变体插入到ndv载体中时，hn-rbd可提高ndv病毒囊膜表面s蛋白的展示量，同时，病毒粒子表面更多的s蛋白可使灭活疫苗免疫原性大幅提升。
[0069]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。