一种自发永生化绵羊肾细胞系及其培养方式与应用的制作方法

1.本发明涉及一种自发永生化的绵羊肾细胞系，培养方式及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.山羊痘(goatpox，gp)是由山羊痘病毒(goatpox virus，gpv)引起的一种严重危害山羊的一种急性、高度接触性传染病，该病毒在自然条件下一般只感染山羊。目前我国主要采用山羊痘活疫苗(av41株)来预防该病，同时该疫苗对绵羊痘、牛结节性皮肤病也具有很好的保护效果。山羊痘病毒主要感染羊的原代细胞，如羊睾丸细胞、羊肾细胞、羊鼻甲粘膜细胞、羊口腔粘膜细胞、羊皮肤细胞等。对个别传代细胞如vero细胞也有一定的感染性，但是山羊痘病毒在这种细胞上不能连续传代，即感染vero后收获的病毒失去了再次感染能力，无法继续作为种毒进行使用。
3.目前山羊痘活疫苗主要采用2-3月龄羊去势的羊睾丸细胞进行生产，该生产工艺需采集大量的羊睾丸，制备羊原代睾丸细胞进行抗原生产。由于原代细胞制备工艺繁琐，一次性大量制备易污染，此外，多个羊的睾丸细胞混合后进行疫苗种毒和抗原制备也容易引发外源病毒污染，造成疫苗批次间不稳定，质量可控性较差。另外，羊的配种、繁殖具有明显的季节性，特别是在羊养殖不发达的地区很难在一个时间点收集大量的睾丸进行疫苗生产，使得疫苗的产能受时间和地域限制。目前国内外尚没有可用于山羊痘病毒疫苗抗原产业化生产的传代细胞系，为了克服现有技术的不足，寻找到一株适合山羊痘病毒疫苗抗原生产的传代细胞系将为山羊痘、绵羊痘、牛结节性皮肤病等疾病的防控带来积极的影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株适合山羊痘病毒疫苗抗原生产的传代细胞系将为山羊痘、绵羊痘、牛结节性皮肤病等疾病的防控带来积极的影响。该细胞系对山羊痘病毒高度易感，具有增殖速度快、易于放大、病变快、效价高的特点。用该细胞系进行山羊痘疫苗的生产实现了山羊痘病毒的传代细胞培养工艺，无需采集羊睾丸组织，操作简单，大大减少了羊源外源病毒污染风险，同时提高了生产效率和批次间稳定性，易于实现产业化，利用该工艺进行疫苗生产大大简化了山羊痘疫苗抗原的生产工艺，降低了生产成本，保证了批间稳定性，对疫苗产业化生产具有重要意义。
5.本发明还改进山羊痘疫苗现有抗原生产工艺技术，建立一种自发永生化的绵羊肾细胞系驯化及其培养方法，并将其用于山羊痘疫苗抗原传代细胞生产，弥补现有技术空白。解决了目前山羊痘疫苗抗原效价低、羊睾丸来源受限、容易引入外源病毒污染、生产工艺繁琐、生产成本高等诸多不利因素。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
7.本发明提供一种绵羊肾细胞系，本发明利用孕3月龄的胎羊肾脏进行原代肾细胞分离、纯化、连续传代培养，最终获得一株纯度高、能稳定传代的自发永生化绵羊肾细胞系，
名称为绵羊肾细胞系lk-2，分类名称为绵羊肾细胞系，已经于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为：cgmcc no.45236。
8.具体的，本发明所述的绵羊肾细胞系lk-2通过以下方式获得:
9.选取怀孕3月龄左右的母绵羊，麻醉后剖腹取出完整的子宫，在子宫颈处结扎保证胎儿处于无菌状态。将子宫浸泡在冷的pbs中，快速带回实验室。随后利用75％酒精擦拭子宫表面进行消毒，消毒后转移至无菌操作台，在操作台中无菌取出羊胎儿，随后将羊胎儿解剖取出肾脏组织。小心剥离被膜，将肾脏纵向切开，去除肾脏髓质、血管等中间白色组织。
10.取一块棕色皮质部分用眼科剪剪成1mm3的碎块，然后用1ml的移液器吸取单个组织块，接种于t25细胞培养瓶中，将接种密度控制在组织块间距大概0.5厘米，共接种10个t25细胞培养瓶，接种时细胞培养瓶中不加培养基。接种完成后将t25细胞培养瓶倒置放入二氧化碳培养箱中培养2小时，使肾组织块干燥固定。随后向细胞培养瓶中沿瓶壁缓慢加入2毫升细胞生长完全培养基(dmem/f12+8％新生牛血清(nbs)+1ug/ml氢化可得松+5μg/ml重组人表皮生长因子(rh-egf)，以下简称“完全培养基”)然后将细胞培养瓶正置放置于二氧化碳培养箱，37℃5％浓度co2培养，培养72h后弃掉细胞培养瓶中培养基，重新加入2ml完全培养基，此时可观察到组织块周围有细胞爬出，培养至第五天细胞汇合度达到80％左右，吸去培养液，pbs洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，使用细胞生长培养基终止消化，细胞按照1:2的比例进行传代，置于37℃、5％ co2培养箱中培养。此时细胞培养瓶中主要存在肾成纤维细胞、肾系膜细胞、肾上皮细胞和肾内皮细胞4种细胞，根据每种细胞贴壁性能差异，可利用0.25％胰酶差速消化法将其分离纯化，最终得到需要的肾上皮细胞，通过有限稀释方法对纯化的细胞进行再次纯化并挑选细胞生长状态好的单克隆进行传代培养。细胞稳定传代超过40代，获得自发永生化的绵羊肾细胞系lk-2。
11.本发明细胞系的应用：
12.从外观形态看该细胞连续传代40代仍保持原代细胞的形态特征，核型分析表明该细胞连续传代40代未发生染色体变异。本发明通过试验发现，该细胞系对山羊痘病毒(av-41疫苗株)非常易感，接毒48小时即可产生明显的致细胞病变现象(cpe)，培养96小时及细胞病变可达几乎100％，接毒后96小时收获的病毒液病毒含量可达10
7.5
tcid
50
/ml以上，与现有原代睾丸细胞生产工艺相比，具有病变快、收毒时间短、效价高的特点。同时该细胞系对牛结节性皮肤病病毒亦非常易感，可用于牛结节性皮肤病病毒的分离及培养。
13.基于此，本发明提供一种上述绵羊肾细胞系的制备方法及其在山羊痘病毒培养中的应用。
14.本发明提供的所述绵羊肾细胞系在山羊痘病毒属(capripoxvirus,capv)病毒的分离和/或培养中的应用。所述山羊痘病毒属(capripoxvirus,capv)病毒包括山羊痘病毒(goatpox virus,gpv)、绵羊痘病毒(sheeppox virus,spv)和牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,lsdv)。
15.本发明提供的所述的绵羊肾细胞系的培养方法，该方法使用完全培养基培养所述绵羊肾细胞系；所述完全培养基是dmem/f12培养基中添加了新生牛血清(nbs)、氢化可得松和重组人表皮生长因子得到的培养基。
16.所述完全培养基优选为dmem/f12培养基中添加了质量百分浓度为8％的新生牛血
清、1ug/ml氢化可得松以及5μg/ml重组人表皮生长因子的培养基。
17.优选的，所述绵羊肾细胞系在细胞培养板中，在37℃、5％co2培养箱内培养。
18.本发明还提供一种山羊痘病毒属病毒的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
19.1)培养绵羊肾细胞系lk-2长成致密单层后1:6的比例进行传代；
20.2)培养24h后绵羊肾细胞系lk-2长成单层细胞，弃去生长液，按培养体积的0.5％-1％的接种量接种山羊痘病毒，37℃吸附60min，吸附后加入细胞维持液置37℃温室中继续培养；所述细胞维持液为含质量百分浓度为3％新生牛血清的dmem/f12培养液，ph7.2；
21.3)培养96小时，细胞病变高于90％时收毒，反复冻融两次，获得病毒液；
22.所述绵羊肾细胞系lk-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为cgmcc no.45236。
23.本发明的有益效果：
24.本发明的细胞系是通过对绵羊肾细胞进行分离、培养、纯化后获得的上皮样细胞，经过自然传代得到绵羊肾细胞系lk-2，该细胞系第40代的细胞仍保持原代细胞的形态特征，核型分析表明连续传代40代后细胞没有发生染色体变异。该细胞系对山羊痘病毒高度易感，接毒后48h通过间接免疫荧光观察到细胞感染率接近100％，培养96小时细胞病变率高于90％，培养96小时收获的病毒液病毒含量最高可达10
7.7
tcid
50
/ml，用该细胞系培养的山羊痘病毒比原代羊睾丸细胞至少高1个滴度，并且该细胞系具有增殖速度快、易于放大、病变快、效价高的特点。用该细胞系进行山羊痘疫苗的生产实现了山羊痘病毒的传代细胞培养工艺，无需采集羊睾丸组织，操作简单，大大减少了羊源外源病毒污染风险，同时提高了生产效率和批次间稳定性，易于实现产业化，利用该工艺进行疫苗生产大大简化了山羊痘疫苗抗原的生产工艺，降低了生产成本，保证了批间稳定性，对疫苗产业化生产具有重要意义。
附图说明
25.图1是本发明实施例提供的组织贴块法分离、培养、纯化胎羊肾细胞。a：贴块法培养3天从组织块中爬出的细胞；b:胰酶差速消化法纯化胎羊肾上皮样细胞；c：纯化后的胎羊肾上皮样细胞。
26.图2是本发明实施例提供的纯化的绵羊肾细胞系lk-2照片。a:第5代；b:第25代；c:第40代。
27.图3是本发明实施例提供的绵羊肾细胞系lk-2间接免疫荧光鉴定示意图。a:hoechst33342染核；b:泛角蛋白ck19抗体荧光标记；c:merger。
28.图4是本发明实施例提供的绵羊肾细胞系lk-2核型分析结果染色体配对示意图。
29.图5是本发明实施例提供的绵羊肾细胞系lk-2第40代细胞周期分布示意图。
30.图6是本发明实施例提供的抗山羊痘病毒p32蛋白单克隆抗体间接免疫荧光照片。a：绵羊肾细胞系lk-2感染48h cpe b:山羊痘病毒p32蛋白单克隆抗体间接免疫荧光；c:lk-2阴性细胞对照。
31.图7是本发明实施例提供的山羊痘病毒(av41疫苗株)在bhk-21细胞、2月龄原代羊睾丸细胞、胎羊原代肾细胞和绵羊肾细胞系lk-2上的病变情况。a1:bhk-21细胞培养96h对照；a2:bhk-21细胞接山羊痘病毒(av41)后96h病变情况；b1:2月龄原代羊睾丸细胞96h对
照；b2:2月龄原代羊睾丸细胞接山羊痘病毒(av41)后96h病变情况；c1:胎羊原代肾细胞96h对照；c2:胎羊原代肾细胞接山羊痘病毒(av41)后96h病变情况；d1:绵羊肾细胞系lk-2(f40代)96h对照；d2:绵羊肾细胞系lk-2(f40代)接山羊痘病毒(av41)后96h病变情况。
32.图8是本发明实施例提供的牛结节性皮肤病病毒在绵羊肾细胞系lk-2上的病变情况。a：接种病料72h病变情况；b接种病料120h病变情况。
33.图9是本发明实施例提供的抗山羊痘病毒p32蛋白单克隆抗体间接免疫荧光试验检测牛结节性皮肤病病毒感染绵羊肾细胞系lk-2后的荧光照片。a：牛结节性皮肤病病毒感染绵羊肾细胞系lk-2 72h cpe b:山羊痘病毒p32蛋白单克隆抗体间接免疫荧光；c:lk-2阴性细胞对照。
具体实施方式
34.下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
35.实施例1、绵羊肾细胞系的获得
36.1.绵羊肾细胞的分离及培养
37.选取怀孕3月龄左右的绵羊，麻醉后剖腹取出完整的子宫，在子宫颈处结扎保证胎儿处于无菌状态。将子宫浸泡在冷的pbs中，快速带回实验室。随后利用75％酒精擦拭子宫表面消毒，消毒后转移至无菌操作台，在操作台中无菌取出羊胎儿，随后将羊胎儿解剖取出肾脏组织。小心剥离肾脏被膜，然后将肾脏纵向切开，去除肾脏髓质、血管等中间白色组织。取一块棕色皮质部分用眼科剪剪成1mm3的碎块，然后用1ml的移液器吸取单个组织块，接种于t25细胞培养瓶中，将接种密度控制在不同组织块间距大概0.5厘米，共接种10个t25细胞培养瓶，接种时细胞培养瓶中不加培养基。接种完成后将t25细胞培养瓶倒置放入二氧化碳培养箱中培养2小时，使肾组织块干燥固定。随后向细胞培养瓶中沿瓶壁缓慢加入2毫升细胞生长完全培养基(dmem/f12培养基中添加了质量百分浓度为8％的新生牛血清、1ug/ml氢化可得松以及5μg/ml重组人表皮生长因子的培养基)，然后将细胞培养瓶正置放置于二氧化碳培养箱，37℃5％浓度co2培养，培养72h后弃掉细胞培养瓶中培养基，重新加入2ml完全培养基(dmem/f12培养基中添加了质量百分浓度为8％的新生牛血清、1ug/ml氢化可得松以及5μg/ml重组人表皮生长因子的培养基)，此时可观察到组织块周围有细胞爬出，培养至第五天细胞汇合度达到80％左右，吸去培养液，pbs洗三遍，加入0.25％(质量百分含量)胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，使用细胞生长培养基终止消化，细胞按照1:2的比例进行传代，置于37℃、5％ co2培养箱中培养(图1)。
38.2.绵羊肾细胞的纯化
39.继续置于二氧化碳培养箱中培养，培养至第五天细胞汇合度达到80％左右，此时细胞培养瓶中主要存在肾成纤维细胞、肾系膜细胞、肾上皮细胞和肾内皮细胞4种细胞，根据每种细胞贴壁性能差异，可利用0.25％胰酶差速消化法将其分离纯化，最终得到需要的肾上皮细胞。胰酶差速消化方法如下：弃掉细胞培养瓶中培养液，加入1ml胰酶洗去残留血清后弃掉，然后向t25细胞培养瓶中重新加入0.5毫升胰酶，将细胞瓶放置于显微镜下，在室温条件下进行消化，2min左右可见梭形的肾成纤维细胞、肾系膜细胞变圆脱落，用pbs洗去消化下的细胞，然后向细胞培养瓶中重新加入0.5ml胰酶，置于细胞培养箱中37℃条件下消化3min，可见上皮样细胞变圆脱落，瓶中剩下的铺路石样的肾内皮细胞因贴壁性最强，未被
消化下来。用5ml完全培养基将细胞瓶中被消化下来的肾上皮细胞重悬，铺到一个新的t25细胞培养瓶中，48小时左右细胞可达到致密单层，此时细胞为均一的上皮样细胞。
40.3.单克隆细胞的筛选及培养
41.采用有限稀释法在96孔板里进行，每孔加入100ul细胞完全培养基(a1孔不加)，对消化的细胞悬液进行细胞计数后，将细胞稀释到104细胞/ml，向a1孔中加入200ul细胞悬浮液，然后用单通道移液器快速地从a1孔中转移100ul至b1孔中，轻轻吹打混匀，同时避免出现气泡。使用相同的枪头重复1:2稀释比例到此列最后一孔，最后一孔h1吸出100ul培养基，使其与其它孔保持相同体积。用8通道移液器添加100ul培养基到第一列各孔(使得细胞和培养基的最终体积为200ul/孔)，然后用同样的枪头迅速从第一列(a1到h1)孔中转移100ul到第二列(a2至h2)孔中，轻轻吹打混匀，避免气泡。使用同样的枪头1:2稀释比例到最后一列，最后一列(a12到h12)每孔吸出100ul培养基，使得96孔板中所有的孔都是100ul细胞悬液。向96孔板每孔加入100ul培养基，使得所有的孔中最终体积为200ul，然后将日期和细胞类型标记在96孔板上。将微孔板放在5％二氧化碳培养箱中，37℃培养7-10天后在显微镜下进行观察，检查每一个孔并将只含有单个克隆的孔进行标记，共标记6株细胞，分别标记为lk-1、lk-2、lk-3、lk-4、lk-5、lk-6，在37℃、5％co2培养箱内培养，待细胞生长至80％～90％融合时，扩大培养。扩大培养的顺序为96孔板、48孔、24孔板、12孔板、6孔板、25cm2细胞瓶、75cm2细胞瓶。在传代扩大培养期间淘汰生长不良和不能稳定传代的细胞株，最终获得了一株纯度高、能稳定传代的自发永生化绵羊肾细胞系lk-2，该细胞系第40代的细胞仍保存原代细胞的形态特征(图2)。
42.该自发永生化绵羊肾细胞系lk-2已经于2021年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为cgmcc no.45236。
43.实施例2、间接免疫荧光法鉴定细胞类型
44.1.细胞爬片：在24孔细胞培养板孔内放置无菌的盖玻片，将绵羊肾细胞系lk-2用胰酶消化成单个细胞，细胞计数后调整细胞浓度为2
×
105个/ml，每孔加入1ml细胞悬液。置于37℃5％ co2培养箱中培养过夜。
45.2.固定：细胞爬片后，吸去培养基，用pbs(0.01mol/l，ph7.2)洗3次，每次3～5min，加入4％多聚甲醛磷酸缓冲液，4℃固定30min。弃去固定液，自然风干。用pbs洗3次，每次3～5min。
46.3.破膜封闭：取40μl破膜封闭液(0.5％ trition x-100与pbs1:1混合，再加10％血清)滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。pbs洗3次，每次3～5min。
47.4.一抗孵育：破膜封闭后，加入1:100倍稀释的anti-cytokeratin 19抗体[epr1579y](abcam，货号ab76539)50μl于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上，放入湿盒内，4℃过夜。pbs洗3次，每次3～5min。
[0048]
5.二抗孵育：弃去pbs，室温避光孵育1:1000倍稀释的fitc goat anti-mouse lgg h&l(abcam，货号6785)2h后，pbs洗3次，每次3～5min。
[0049]
6.染核：用终浓度为5μg/l的hoechst33342，室温染色3～5min。pbs洗3次，每次3～5min。荧光显微镜下观察，照相。
[0050]
结果如图3所示，经过anti-cytokeratin 19抗体免疫荧光鉴定，百分百的细胞均
被染色，细胞形态完整、均一性好。
[0051]
实施例3染色体核型分析
[0052]
1.将绵羊肾细胞系lk-2(f40代)置于37℃、5％ co2培养箱中培养，培养68h时，加入秋水仙素，使秋水仙最终浓度达到0.25μg/ml，温箱中继续培养5～6h使细胞分裂停止在中期相；
[0053]
2.制备染色体玻片：
[0054]
2.1收集细胞：倒掉细胞瓶中的培养基，pbs洗三遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当大部分中期细胞变圆脱落时，终止消化，收集细胞移入15ml的离心管内，1000r/min离心10min，弃上清液，留细胞沉淀物；
[0055]
2.2低渗处理：加入经37℃预热的0.075m kcl低渗液5ml。用吸管吹匀，使细胞悬浮于低渗液中，置37℃水浴中处理20min；
[0056]
2.3预固定：加入新配制的1ml甲醇：乙酸(3∶1)固定液，轻轻吹匀，1000r/min离心10min，弃上清液；
[0057]
2.4第一次固定：沿管壁加入固定液5ml，用吸管轻轻吹匀，在室温下静置15min，以1000r/min离心10min，弃上清液；
[0058]
2.5第二次固定：加固定液5ml，室温下再固定15min，1000r/min离心10min，弃上清液；
[0059]
2.6制片：加固定液0.4ml，重悬细胞。在预先经冰冻冷却的载玻片上，每片滴加2～3滴细胞悬液，火焰固定。
[0060]
2.7染色：取1张制备好的染色体标本片子，将1ml giemsa(用ph7.4磷酸缓冲稀释10倍)注入，染色15～20min，水冲洗，室温空气干燥。
[0061]
3.染色体核型分析：
[0062]
在分裂相区域滴加pbs后，镜检，照相，使用video test.karyo染色体核型分析系统进行核型分析。
[0063]
正常绵羊体细胞有27对染色体。染色体核型分析结果显示，本发明获得的自发永生化的绵羊肾细胞系含有27对54条染色体(图4)，没有发生染色体条数变异。
[0064]
实施例4细胞周期分析
[0065]
应用流式细胞术分析自发永生化的绵羊肾细胞系lk-2第40代的生长周期，具体步骤如下：
[0066]
1.将培养的细胞用0.25％的胰酶消化下来，终止后用1000r/min离心5min，用pbs洗一遍，1000r/min离心5min，弃上清。
[0067]
2.-20℃预冷的70％乙醇逐滴加入细胞中，边加边漩涡混匀。-20℃冷冻细胞过夜。
[0068]
3.离心去除乙醇，再用pbs洗2遍，1000r/min离心5min，弃上清。
[0069]
4.加入500μl pi(终浓度为50μg/ml)染液37℃孵育15min，进行流式细胞仪分析。
[0070]
细胞周期检测结果如图5所示，细胞处于g1期、s期、g2期的比例分别是61.32％、29.12、9.56％。本发明所制备的胎羊肾细胞lk-2s期所占比例为29.12％，说明其分裂增殖能力旺盛。
[0071]
实施例5绵羊肾细胞系lk-2在山羊痘病毒培养中的应用
[0072]
1.绵羊肾细胞系lk-2对山羊痘病毒(av41)的易感性评价
[0073]
选择在96孔细胞培养板中细胞状态良好、培养24h的lk-2细胞单层(f40代)，弃去生长液，按培养体积的0.5％的接种比例接种山羊痘病毒(av41),37℃吸附60min(吸附期间每20min摇晃一次细胞瓶)，吸附后加入细胞维持液(含3％新生牛血清的dmem/f12培养液，ph7.2)置37℃、5％co2培养箱中继续培养，接毒48小时后用山羊痘病毒p32蛋白单抗进行间接免疫荧光检测，观察细胞感染率，判断该细胞对山羊痘病毒(av41)的易感性，具体操作如下：
[0074]
1)弃掉培养液，每孔加入200μlpbs，用pbs清洗96孔板2次。
[0075]
2)每孔加入100μl-20℃预冷的固定液(丙酮：甲醇1:1)，-20℃固定30min，弃掉固定液。
[0076]
3)每孔加入200μlpbs，静置1min，弃去pbs，然后再重复洗板1次。
[0077]
4)弃掉清洗液，每孔加入50μl3％bsa(或bsa-v)封闭液，37℃封闭30min。
[0078]
5)重复步骤3)。
[0079]
6)弃掉清洗液，加入50μl羊痘病毒p32蛋白单抗稀释液(1:3000稀释)，37
°
c湿盒中孵育1.5h。
[0080]
7)重复步骤3)。
[0081]
8)加入50ul羊抗鼠二抗稀释液(1:100稀释)37℃孵育1h。
[0082]
9)重复步骤3)。
[0083]
10)荧光显微镜(fitc)观察。
[0084]
结果如图6所示，结果表明绵羊肾细胞系lk-2感染山羊痘病毒，接毒后48h，通过间接免疫荧光观察到细胞感染率接近100％，说明山羊痘病毒高度易感绵羊肾细胞系lk-2细胞。
[0085]
2.山羊痘病毒的培养
[0086]
选择细胞状态良好、培养24h的bhk-21细胞、2月龄原代羊睾丸细胞、胎羊原代肾细胞和绵羊肾细胞系lk-2(f40代)，弃去生长液，按培养体积的0.5％的接种量分别接种山羊痘病毒(av41株)，37℃吸附60min(吸附期间每20min摇晃一次细胞瓶)，吸附后加入细胞维持液(含3％新生牛血清的dmem/f12培养液，ph7.2)置37℃、5％co2培养箱中继续培养，接毒后观察细胞病变，当病变达90％以上时收获病毒液。bhk-21细胞、2月龄原代羊睾丸细胞、胎羊原代肾细胞和绵羊肾细胞系lk-2出现细胞病变时间分别为96h、44h、36h、36h，收毒时间分别为168h、120h、96h、96h。结果见表1。
[0087]
3.病毒含量的测定
[0088]
用2月龄原代羊睾丸细胞进行检测，具体方法如下：将收获的病毒液用无血清dmem/f12培养基进行10倍系列稀释，稀释后接种于96孔板内，每一稀释度毒液接种8孔，0.1ml/孔。然后向96孔板种加入2月龄原代羊睾丸细胞，每块96孔板加入的细胞量为2
×
106。置37℃、5％co2培养箱中继续培养120h，观察细胞cpe，用reed-muench两氏法计算不同细胞培养的山羊痘病毒的毒价(lgtcid
50
/ml)。结果见表1和图7所示。
[0089]
表1山羊痘病毒在bhk-21细胞、2月龄原代羊睾丸细胞、胎羊原代肾细胞和绵羊肾细胞系lk-2上观察培养和病毒含量测定
[0090][0091]
结果表明，该细胞系培养96小时细胞病变率高于90％，培养96小时收获的病毒液病毒含量为10
7.5
tcid
50
/ml，用该细胞系培养的山羊痘病毒比原代羊睾丸细胞至少高1个滴度，该细胞系具有增殖速度快、易于放大、病变快、效价高的特点。
[0092]
实施例6、绵羊肾细胞系lk-2在牛结节性皮肤病病毒分离、培养中的应用
[0093]
将疑似患牛结节性皮肤病的病牛皮肤结痂研磨，然后用5ml含10％青-链霉素的pbs溶液重悬，3000r/min离心10min，取500ul上清液接种于单层绵羊肾细胞系lk-2的t25细胞培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中进行孵育1小时(吸附期间每20min摇晃一次细胞瓶)，孵育后加入细胞维持液(含3％新生牛血清的dmem/f12培养液，ph7.2)置37℃、5％co2培养箱中继续培养。在72h出现明显病变，培养至120h病变达到90％以上(图8)，收毒后在-20℃条件下反复冻融3次。将该病毒在绵羊肾细胞系lk-2上以2％接毒比例连续接毒传代，均在第2天出现病变，第4天病变可达90％以上。
[0094]
由于牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒高度同源，有文章报道山羊痘病毒单抗可于牛结节性皮肤病病毒结合，本发明通过使用山羊痘病毒p32蛋白单抗进行间接免疫荧光检测，可观察到被感染细胞为绿色荧光，阴性对照无荧光，初步证明该病毒为牛结节性皮肤病病毒。(图9)
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为进一步确认分离病毒为牛结节性皮肤病病毒，在病毒tk基因的两侧设计测序引物，将测序的序列控制在2000左右(序列表中序列1)，引物序列为：forward primer(56786-56808)5'-ttagaatcaccagagccgataa-3'/reverse primer(58593-58611)5'-acaatagccgagaccact-3'。通过ncbi进行在线序列比对分析，证明分离到的该病毒为牛结节性皮肤病病毒。
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从以上结果可以看出，绵羊肾细胞系lk-2对山羊痘病毒(av41株)高度易感，传代至第40代接毒后对山羊痘病毒(av41株)的易感性仍未降低，毒价可达7.5lgtcid
50
/ml，毒价远远高于现有山羊痘活疫苗生产工艺中用2月龄原代睾丸细胞生产抗原的工艺。并且该细胞传代比例可达1:6，增殖速度快，易于放大，可直接用于产业化生产。该细胞系发明可直接用于山羊痘病毒属(山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒)的分离及疫苗生产。