一种富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法与流程

一种富含
ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法。


背景技术：

2.磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称ps)又称丝氨酸磷脂，二酰甘油酰磷酸丝氨酸，能够通过提升脑神经刺突的数量、细胞膜的流动性以及葡萄糖代谢循环速度，对很多细胞代谢过程起到十分重要的调节作用。具有直接或间接响大脑内化学信息的传递以及脑细胞信号的贮存功能。经临床试验验证，ps的摄入对阿尔兹莫氏症具有很好疗效。ps能够调节脑内情绪神经传输递质的激素水平，同时可以抑制血清中促肾上腺皮质激素和可的松等的水平，有临床案例研究，ps对抑郁症病人情绪紊乱、行为异常、焦虑及易怒等症状具有明显改善效果。ps是神经系统中一种重要营养物质，不仅可以激活神经传输过程各种酶的活性能力，减缓神经递质的减少，还可以修复多种脑部损伤，清除多数有害物质，对因为脑营养不良、脑部损伤或遗传性神经递质数量下降所造成的小儿多动症均有着优越的治疗效果。
3.目前ps的取得有两种途径，一是从植物体内直接提取分离(常见原料为大豆)，分离方法有：吸附分离法、低级醇分离法、co2超临界萃取法、膜分离法等，二是以大豆磷脂为原料，通过酶催化法制得。2010年，我国将ps列入新资源食品名单，就是大豆卵磷脂和l-丝氨酸为原料，采用磷脂酶转化反应后，经分离纯化、干燥后制得。
4.目前商品化的ps主要是以大豆卵磷脂(即磷脂酰胆碱：1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱，简称pc)为原料利用酶催化法制备而成，其c1，c2上是饱和的脂肪酸链。由于南极磷虾油中epa、dha主要是以磷脂的形式存在即epa/dha型pc，其脂肪酸链是不饱和的，相比于以大豆卵磷脂为原料，以南极磷虾油中epa/dha型pc制备的ps，其含有大量的不饱和脂肪酸链，这种特殊的结构具有更高的生物利用度，从而发挥更好的生理功能及营养特性。本发明针对南极磷虾油中磷脂优越的结构特点，以此为原料利用酶催化法制备的ps，以期得到具有pufan-3和ps双重生物活性的磷脂酰丝氨酸。
5.秦鑫鑫等人，利用超临界co2体系制备富含dha的南极磷虾磷脂酰丝氨酸以超临co2为非水反应介质,以南极磷虾中提取的磷脂酰胆碱为原料，在磷脂酶a1的作用下使游离的dha结合到磷脂酰胆碱上，制备富含dha的磷脂酰胆碱(dha-pc),再通过磷脂酶d改性成富含dha的磷脂酰丝氨酸(dha-ps)；此方法制备工艺较为复杂，在制备过程中涉及丙酮等有毒物质，dha的提取纯度不高、dha-pc制备过程中会有较多的副产物。张芹等人，以鱿鱼卵磷脂和l-丝氨酸为原料,对磷脂酶d催化酰基转移反应制备富含二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸，购买的磷脂酶d价格昂贵，成本极高。cn201710498577.3公开了一种利用固定化磷脂酶d生产磷脂酰丝氨酸的方法,配制表面活性剂水溶液,室温下边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清,得混合液；将混合液滴加至金属离子盐溶液中,室温下搅拌反应0.5-2h后得固定化的酶溶液；离心,干燥得到固定化的磷脂酶催化剂；将溶于有机相中的卵磷脂、丝氨酸溶液与固
定化酶进行转化反应,温度0-40℃,时间1-24h；该方法中使用金属离子、干燥等步骤都会对酶活有较大的损失，且工艺复杂。
6.采用游离酶的方法可以避免上述问题，但是游离酶在使用过程中通常是一次性加入，催化反应完成后，由于回收难度大而废弃了剩余仍有活性的酶，造成酶的利用率较低，酶试剂成本增大。此外，游离酶混合在反应体系中，也会给产物的分离纯化也带来了相当的挑战。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法，同时具备磷脂酰丝氨酸、epa及dha的生物功效，蕴含巨大的开发价值。同时，延伸了南极磷虾产业链，推动南极磷虾产业的转型升级，对我国充分利用南极渔业资源，占领南极生物战略资源加工利用制高点，争取我国南极资源开发利用长远权益具有重要的战略意义。
8.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备有机相：将南极磷虾油加入有机溶剂中混匀，得有机相；(2)制备水相：将四氧化三铁纳米颗粒加入ph＝8-9、浓度10-15mmol/ml的tris-hcl缓冲液中，同时快速搅拌，接着加入盐酸多巴胺，30-40℃下搅拌聚合20-25小时，离心过滤，干燥后得到聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒加入到磷脂酶d溶液中，25-30℃下200-300r/min恒温振荡1-3小时，过滤，醋酸-醋酸钠缓冲液清洗后，甩干，得到负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒、丝氨酸加入醋酸-醋酸钠缓冲液中搅拌均匀得到水相；(3)混合反应：将水相和有机相按照1:0.5-3的体积比混合，38-40℃下100-150r/min恒温振荡5-8小时，向反应体系中加入磁体吸附负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒，然后静置分层，取有机相进一步处理；取出磁体清洗，收集负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒后循环使用；(4)提取产物：取有机相，加入2-3倍体积的氯仿，混匀后静置分层，取氯仿层，减压蒸馏得富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的产物。
9.固定化酶具有优于游离酶的稳定性和可操作性，以及独有的重复使用性能，能够明显提高酶的使用效率，降低酶的使用成本。常规的交联固定法，固定化过程不易控制，重现性较差，最明显的缺点是固定化酶的机械强度不足，极易破碎，且亲水性也不佳，难以在水相中均匀分布，化学交联剂的使用也会给食品安全带来潜在的隐患。
10.多巴胺在碱性缓冲液中进行氧化自聚可以在四氧化三铁表面沉积一层聚多巴薄膜，赋予载体表面良好的亲水性和活泼的化学反应活性，然后以共价键的方式将磷脂酶d进行固定。这样形成的固定化酶机械强度好，亲水性好，不使用化学交联剂，安全性好，通过磁性吸附能简单回收利用。
11.在单一水相中磷脂酶有很高的水解活性而转酯活性较低，因此，单一水相中不适
合用磷脂酶进行转酯反应来生产磷脂酰丝氨酸。本发明设计两相反应体系，使南极磷虾油磷脂与丝氨酸在磷脂酶d的作用下，在界面发生转酯反应，制备ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸，这样磷脂酶d转酯活性高。同时本发明采用特定的负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒作为酶催化剂，其良好的亲水性使得颗粒能够在水相中分散均匀，从而发挥更好地催化活性，能够使得固定化酶像游离酶一样使用；同时固定化在四氧化三铁表面后，比表面积大，酶的作用效率高，通过简单的磁性吸附后就能回收酶，然后进行重新利用，酶的利用效率高，成本低。
12.作为优选，步骤(1)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
13.作为优选，所述南极磷虾油的浓度为10-12mg/ml。
14.作为优选，四氧化三铁纳米颗粒、tris-hcl缓冲液及盐酸多巴胺的用量为：四氧化三铁纳米颗粒10g，tris-hcl缓冲液及2-2.5l，盐酸多巴胺8-12g。
15.作为优选，磷脂酶d溶液是将磷脂酶d加入到醋酸-醋酸钠缓冲液中形成，磷脂酶d浓度为5-10u/ml。
16.作为优选，步骤(2)中，所述水相中丝氨酸浓度为0.1-0.2g/ml，磷脂酶d浓度为1u-2u/ml。
17.作为优选，步骤(2)中，聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒加入到磷脂酶d溶液中两者的用量比为1g：5-10ml。
18.作为优选，步骤(3)中，水相和有机相按照1:1的体积比混合。
19.作为优选，醋酸-醋酸钠缓冲液的ph为4-4.2。
20.本发明的有益效果是：以高磷脂的南极磷虾油为原料，两相体系中，在l-丝氨酸的存在下，固定化的磷脂酶d为酶催化剂进行转酯反应，转酯效率高，酶能简单重复利用，重复使用后酶活性损失少，酶的利用效率高，成本低，绿色安全。
附图说明
21.图1是图1不同反应温度对ps得率的影响；图2是不同ph值对ps得率的影响；图3是有机相与水相的体积比对ps得率的影响；图4是丝氨酸与南极磷虾油质量比对ps得率的影响；图5是不同反应时间对ps得率的影响。
具体实施方式
22.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
23.本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
24.实施例1：一种富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备有机相：将南极磷虾油加入乙酸乙酯中混匀，得有机相，所述南极磷虾油的浓度为10mg/ml；(2)制备水相：
将10g四氧化三铁纳米颗粒(100-200nm)加入ph＝8、浓度10mmol/ml的tris-hcl缓冲液2中，同时快速搅拌，接着加入盐酸多巴胺8g，30℃下搅拌聚合25小时，离心过滤，干燥后得到聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将磷脂酶d加入到醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)中形成浓度为5u/ml的磷脂酶d溶液；将聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒加入到磷脂酶d溶液中(两者的用量比为1g：10ml)，25℃下200r/min恒温振荡3小时，过滤，醋酸-醋酸钠缓冲液清洗后，甩干，得到负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒、丝氨酸加入醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)中搅拌均匀得到水相，水相中丝氨酸浓度为0.1g/ml，磷脂酶d浓度为1u/ml；(3)混合反应：将水相和有机相按照1:0.5的体积比混合，38℃下100r/min恒温振荡8小时，向反应体系中加入磁体吸附负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒，然后静置分层，取有机相进一步处理；取出磁体清洗，收集负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒后循环使用；(4)提取产物：取有机相，加入2倍体积的氯仿，混匀后静置分层，取氯仿层，减压蒸馏得富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的产物。
25.实施例2：一种富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备有机相：将南极磷虾油加入乙酸乙酯中混匀，得有机相，所述南极磷虾油的浓度为12mg/ml；(2)制备水相：将10g四氧化三铁纳米颗粒(100-200nm)加入ph＝9、浓度15mmol/ml的tris-hcl缓冲液2.5l中，同时快速搅拌，接着加入盐酸多巴胺12g，40℃下搅拌聚合20小时，离心过滤，干燥后得到聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将磷脂酶d加入到醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)中形成浓度为10u/ml的磷脂酶d溶液；将聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒加入到磷脂酶d溶液中(两者的用量比为1g：5ml)，30℃下00r/min恒温振荡1小时，过滤，醋酸-醋酸钠缓冲液清洗后，甩干，得到负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒、丝氨酸加入醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)中搅拌均匀得到水相，水相中丝氨酸浓度为0.2g/ml，磷脂酶d浓度为2u/ml；(3)混合反应：将水相和有机相按照1:3的体积比混合，40℃下150r/min恒温振荡5小时，向反应体系中加入磁体吸附负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒，然后静置分层，取有机相进一步处理；取出磁体清洗，收集负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒后循环使用；(4)提取产物：取有机相，加入3倍体积的氯仿，混匀后静置分层，取氯仿层，减压蒸馏得富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的产物。
26.实施例3：一种富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备有机相：将南极磷虾油加入乙酸乙酯中混匀，得有机相，所述南极磷虾油的浓度为10mg/ml；
(2)制备水相：将10g四氧化三铁纳米颗粒(100-200nm)加入ph＝8.5、浓度10mmol/ml的tris-hcl缓冲液2l中，同时快速搅拌，接着加入盐酸多巴胺10g，35℃下搅拌聚合24小时，离心过滤，干燥后得到聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将磷脂酶d加入到醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)中形成浓度为8u/ml的磷脂酶d溶液；将聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒加入到磷脂酶d溶液中(两者的用量比为1g：8ml)，28℃下250r/min恒温振荡2小时，过滤，醋酸-醋酸钠缓冲液清洗后，甩干，得到负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；将负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒、丝氨酸加入醋酸-醋酸钠缓冲液(ph4.0)中搅拌均匀得到水相，水相中丝氨酸浓度为0.16g/ml，磷脂酶d浓度为1.5u/ml；(3)混合反应：将水相和有机相按照1:1的体积比混合，40℃下120r/min恒温振荡7小时，向反应体系中加入磁体吸附负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒，然后静置分层，取有机相进一步处理；取出磁体清洗，收集负载磷脂酶d的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒后循环使用；(4)提取产物：取有机相，加入2.5倍体积的氯仿，混匀后静置分层，取氯仿层，减压蒸馏得富含ω-3多不饱和磷脂酰丝氨酸的产物。
27.试验部分一、方法1.1ps检测方法采用agilent 1260高效液相色谱仪测定ps和pc。色谱条件：色谱柱为zorbax rx-sil columns(4.6mm
×
250mm)；以甲醇-水-冰醋酸(体积比79∶14∶0.23)为流动相a，以异丙醇-正己烷-流动相a(体积比45∶20∶27)为流动相b，按表1进行梯度洗脱；柱温为37℃，用蒸发光散射检测器检测(条件：漂移管温度60℃，载气流量1.8ml/min)，洗脱程序如表1。
28.表1梯度洗脱程序时间/min流动相a/％流动相b/％01000150100251000351000。
29.标准曲线的绘制：将ps标样溶解于氯仿/乙腈(体积比7︰2)，配制成浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/ml的标准溶液，用0.22μm的滤膜过滤后，按照以上方法进行hplc分析，以标准溶液浓度(mg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
30.待测样品中ps的定量分析：将待测样品处理后，按照同样的分析条件进行hplc分析，从色谱图中求得峰面积，根据ps标准工作曲线计算进样浓度，从而计算待测样品中ps的总质量。
31.式中，0.6表示南极磷虾油中pc含量以
60％计。
32.1.2epa、dha检测方法参照gb/t 38095—2019dha、epa含量测定气相色谱法。
33.1.4单因素试验按照本发明ps的制备方法，设置3个重复水平的试验，以ps得率为考察指标，以南极磷虾油浓度10mg/ml，丝氨酸与南极磷虾油质量比16∶1，pld添加量为60u(浓度1u/ml)，反应温度40℃为基础，分别考察了有机相种类(正己烷、乙酸乙酯、乙醚)，反应温度(35、40、45、50、55℃)，缓冲液ph值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)，有机相和水相体积比(0.25︰1、0.5︰1、1︰1、2︰1、5︰1、10︰1)，丝氨酸与南极磷虾油质量比(2︰1、4︰1、8︰1、16︰1、24︰1、32︰1)，反应时间(1、2、4、6、8、10h)等各因素对ps得率的影响。
34.1.5正交试验在单因素试验的基础上，设计正交试验l9(34)，并进行3个重复水平的试验，根据试验结果得出ps制备的最佳工艺条件。
35.表2正交试验因素水平表
36.二、结果与分析2.1各因素对ps得率的影响2.1.1有机相种类以极性为指标，选取具有代表性的有机溶剂与醋酸缓冲液混合形成两相反应体系，综合ps得率、有机溶剂沸点及毒性，优选乙酸乙酯作为本研究的有机溶剂。
37.表3表3
38.2.1.2反应温度在一定温度范围内，酶活随反应温度的递增一般呈现先增加后减小的变化，酶活最高点为其最适反应温度。由图1可以看出，在35～55℃的温度范围内，ps的最终合成率相差不大，但观察各温度下ps合成率随时间的变化曲线可以看出，在40℃下ps前4h合成的速度最快，但与45℃反应温度下到达反应平衡状态的时间差别不大，在考虑能耗的情况下，在本试验研究条件中磷脂酶d催化合成ps的最适反应温度为40℃左右。
39.2.1.3缓冲液ph值缓冲液ph值对ps得率的影响，主要是通过影响酶活性部位基团离子化程度和三维结构的共价键发挥作用。在反应体系中，酶具有催化底物磷脂进行两种酶促反应的活性：一
种是磷脂的水解，产生磷脂酸(phosphatidic acid，pa)；另一种就是磷脂酰基转移反应，生成ps。不同ph值对ps得率的影响如图2所示，在ph在3.5～5.5之间，ps得率呈现先增大后减小的趋势，当ph为4.0时，ps的得率达到最大，说明此时酶的转酯活性达到最大。
40.2.1.4有机相与水相体积比两相体积比对ps得率的影响如图3所示，两相反应体系中，ps得率随着有机相与水相体积比的增大，呈现先增加后减少趋势；当体积比小于1∶1时，随着有机相体积比例的增加，酶与磷脂接触几率增大，ps得率增加；当两者体积比达到1∶1时，ps得率达到最大；随着有机相比例继续增大，ps得率开始下降，这可能是由于过高的有机相比例，影响磷脂酶的活性所导致的。
41.2.1.5丝氨酸与南极磷虾油质量比丝氨酸与南极磷虾油质量比对ps得率的影响如图4所示。由图4可知，在丝氨酸与南极磷虾油质量比小于16︰1时，ps得率随着丝氨酸的增加而增大，因为此时丝氨酸作为底物其含量的增加对转酯反应的发生具有促进作用；当两者质量比达到16︰1时，ps得率达到最大值，且再提高丝氨酸比例也不再变化，说明此时南极磷虾油中磷脂与酶形成的复合物已经全部被丝氨酸饱和，因此丝氨酸与南极磷虾油质量比选择16︰1为宜。
42.2.1.6反应时间反应时间对ps得率的影响如图5所示。随着反应的进行，ps得率迅速增加，当反应进行6h后，基本不再变化，说明此时底物基本转酯反应基本停止，因此试验反应时间选择6h。
43.2.2正交试验结果由单因素结果可知，缓冲液ph值、反应温度、有机相与水相的体积比、反应时间对ps得率有较大的影响，因此选这4个因素设计正交试验，结果如表4所示。
44.由表4中极差r值可知，各因素对ps得率的影响大小为：缓冲液ph值》反应时间》有机相与水相的体积比》反应温度，4个因素对制备ps得率的影响均不显著。由于本试验结果是以ps得率为指标，数值越大越理想，比较表4中4个因素的k1、k2、k3大小，取k值最大对应的水平为最佳水平，因此最佳因素水平组合为：a2b2c2d2，即：ph4.0、反应温度40℃、有机相与水相的体积比1︰1、反应时间6h。因此制备ps的最佳工艺条件为：水相ph4、有机相水相体积比1︰1、反应温度40℃、丝氨酸与南极磷虾油质量比16︰1、反应时间6h。此条件下进行3次重复试验，ps得率均值为79.46％(标准偏差s＝0.13)，产物中epa含量为20.53％(标准偏差s＝0.11)，dha含量为17.85％(标准偏差s＝0.12)。
45.表4正交试验结果
46.3讨论本研究中，在有机溶剂种类选择方面，不同极性有机溶剂作用下ps的生成率有所不同，这可能是由于有机溶剂极性影响两相中底物与产物的分配与扩散，从而使反应的平衡常数和速率常数发生变化。其次，不同极性的有机溶剂与酶接触时，对维持酶蛋白活性构型的氢键、疏水键的影响不同，从而导致ps得率有所不同。乙酸乙酯、乙醚、正己烷三种有机溶剂的极性依次减小，溶剂极性越小疏水性越强；南极磷虾油磷脂虽然在正己烷中有较大的溶解度，但由于正己烷强大的疏水性，使其很难进入磷脂酶d的必需水层进行反应。另一方面，溶剂极性越强越容易夺取酶分子的结合水，对酶活力的影响越大，乙酸乙酯对酶活的影响大于乙醚和正己烷。在这两方面影响的共同作用下，以正己烷为有机溶剂的两相反应体系中ps得率最低。
47.磷脂酶d的最适温度和ph值受其来源影响较大，大多数最适催化温度为25～45℃；微生物来源的磷脂酶d最适ph在4～8之间，植物来源的在5～6之间。本试验中磷脂酶d在最适温度为40℃、ph4.0，在此条件下两相体系中转酯反应和水解反应同时进行，水解反应副产物pa会影响目标产物ps的生成，此时两相体积比、底物质量比显得尤为重要。两相体积比主要是对水相中的酶与有机相中底物的接触概率的影响，有机相与水相体积比的增加提高了ps生成率，体积比继续增大时，虽然底物和磷脂酶d的接触概率提高，但酶更容易与有机溶剂接触从而活性降低，因此ps生成率逐渐下降。底物质量比则是通过影响反应的化学平衡，以及与酶的配比从而影响反应结果。因为丝氨酸与酶同处于水相，作为亲核试剂的丝氨酸首先进入酶活性中心，丝氨酸比例的增加形成了更多的丝氨酸-酶复合物，从而提高了ps得率，当丝氨酸达到一定量后，酶活性中心全部被丝氨酸饱和，ps得率达到最大值。
48.本研究通过单因素和正交试验，获得富含ω-3多不饱和脂肪酸的ps最佳制备工艺条件为：pld添加量为60u、缓冲液ph4.0、有机相和水相体积比1︰1、反应温度40℃、l-丝氨酸与南极磷虾油质量比16︰1、反应时间6h；此条件下ps得率为79.46％，其中epa含量为20.53％，dha含量为17.85％。
49.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。