1.本发明涉及单宁酸提取技术领域，具体为一种刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法。
背景技术：
2.单宁酸又称鞣酸、鞣质，存在于多种树木的树皮和果实中，也是这些树木受昆虫侵袭而生成的虫瘿中的主要成分，含量可达50％～70％。具有很强的生物和药理活性，广泛应用于医药、化工、食品、印染、航天、国防、微电子等多个领域，国际国内市场需求量大，前景广阔。
3.刺梨是一种蔷薇科植物缫丝花的果实，主要分布于我国西南地区。刺梨本身集食用、药用、材用等于一身，具有较高的综合利用价值。刺梨的果肉脆甜，有浓芳香味，营养丰富，是滋补健身的佳果，秋季成熟，去刺后洗净、除去种子，可以鲜吃或者晒干用于入药等，具有消食健脾、收敛止泻、消渴解暑、解酒等功效；现有刺梨的加工技术中通常是通过萃取、浓缩、提取、蒸馏等方式提取刺梨内各类有效成分。
4.在植物单宁酸的提取分离方法中，水提取法提取效率一般不高，而且过热会破坏有效成分，多糖丰富的成分过滤也困难；而超临界流体萃取分离过程是利用超临界流体的溶解能力与密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行提取，在现有单宁酸提取工艺中，常以水为溶剂，通过多次加热浸取单宁酸，其存在提取纯度低、浸取率低，工艺繁琐，周期长等问题，但从刺梨中提取单宁酸的技术至今还未有相关报道。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于解决上述问题，提高刺梨有效成分的利用率，增大刺梨的利用范围，本发明提供了一种刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法，包括以下步骤：1）原料精选：将刺梨清洗控水后破碎，制得刺梨果浆备用；2）制配培养基：所述培养基由葡萄糖4份、酵母粉1.5份、黄豆粉5份、玉米粉2份和消泡剂0.2份混合并加入饮用水配制而成；其次将培养基的ph调节至7.0后在110-120℃的条件下消毒25-30min，其次投入发酵罐中并加入复合酶制剂进行16-18h的发酵，制得ⅰ号发酵菌，然后向ⅰ号发酵菌加入0.03份的碳酸氢钙、0.1份的硫酸铵和0.03份的硫酸镁，最后按1.5%的比例向ⅰ号发酵菌中依次加入乳酸菌和醋酸菌的菌液，并进行26-28h的发酵，制得ⅱ号发酵液；3）培养菌的扩培：依次对步骤2）制得的ⅱ号发酵液进行试管培养、三角瓶深层培养和种子罐扩大培养，制得混合培养菌液；4）原料发酵：将步骤3）制得混合培养菌液加入步骤1）制得的刺梨果浆中，搅拌均匀并发酵18-30h后制得混合物；
号发酵液；3）培养菌的扩培：依次对步骤2）制得的ⅱ号发酵液进行试管培养、三角瓶深层培养和种子罐扩大培养，制得混合培养菌液；4）原料发酵：将步骤3）制得混合培养菌液加入步骤1）制得的刺梨果浆中，搅拌均匀并发酵18-30h后制得混合物；5）原料提取：将步骤4）制得的混合物放入至有机水溶剂中，其中混合物与有机水溶剂的体积比为1：7g/ml，进行恒温静置6h，得到混合溶液；6）超声处理：将步骤5）得到的混合溶液恒温超声处理30min后静置，然后再以超声波频率60hz进行超声提取处理90min，提取完成的溶液静置后得到超声静置液；7）离心处理：将步骤6）得到的超声静置液以离心转速为4500r/min，离心8min后得到的上层清液即为单宁酸溶液。
16.实施例2，本发明提供的一种刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法，其中有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.2-1.5:0.6-0.8的用量比制得的混合物，所述乙醇溶液的浓度为55-60%，所述丙酮的浓度为98.5-99.5%，进一步有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.3:0.8的用量比制得的混合物，刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法包括以下步骤：1）原料精选：将100公斤刺梨（单宁酸含量0.6%）清洗控水后破碎，制得刺梨果浆备用；2）制配培养基：所述培养基由葡萄糖4份、酵母粉1.5份、黄豆粉5份、玉米粉2份和消泡剂0.2份混合并加入饮用水配制而成；其次将培养基的ph调节至7.0后在110-120℃的条件下消毒25-30min，其次投入发酵罐中并加入复合酶制剂进行16-18h的发酵，制得ⅰ号发酵菌，然后向ⅰ号发酵菌加入0.03份的碳酸氢钙、0.1份的硫酸铵和0.03份的硫酸镁，最后按1.5%的比例向ⅰ号发酵菌中依次加入乳酸菌和醋酸菌的菌液，并进行26-28h的发酵，制得ⅱ号发酵液；3）培养菌的扩培：依次对步骤2）制得的ⅱ号发酵液进行试管培养、三角瓶深层培养和种子罐扩大培养，制得混合培养菌液；4）原料发酵：将步骤3）制得混合培养菌液加入步骤1）制得的刺梨果浆中，搅拌均匀并发酵18-30h后制得混合物；5）原料提取：将步骤4）制得的混合物放入至有机水溶剂中，其中混合物与有机水溶剂的体积比为1：7g/ml，进行恒温静置5h，得到混合溶液；6）超声处理：将步骤5）得到的混合溶液恒温超声处理30min后静置，然后再以超声波频率60hz进行超声提取处理90min，提取完成的溶液静置后得到超声静置液；7）离心处理：将步骤6）得到的超声静置液以离心转速为4500r/min，离心8min后得到的上层清液即为单宁酸溶液。
17.实施例3，本发明提供的一种刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法，其中有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.2-1.5:0.6-0.8的用量比制得的混合物，所述乙醇溶液的浓度为55-60%，所述丙酮的浓度为98.5-99.5%，进一步有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.1:0.8的用量比制得的混合物，刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法包括以下步骤：1）原料精选：将100公斤刺梨（单宁酸含量0.6%）清洗控水后破碎，制得刺梨果浆备用；2）制配培养基：所述培养基由葡萄糖4份、酵母粉1.5份、黄豆粉5份、玉米粉2份和
消泡剂0.2份混合并加入饮用水配制而成；其次将培养基的ph调节至7.0后在110-120℃的条件下消毒25-30min，其次投入发酵罐中并加入复合酶制剂进行16-18h的发酵，制得ⅰ号发酵菌，然后向ⅰ号发酵菌加入0.03份的碳酸氢钙、0.1份的硫酸铵和0.03份的硫酸镁，最后按1.5%的比例向ⅰ号发酵菌中依次加入乳酸菌和醋酸菌的菌液，并进行26-28h的发酵，制得ⅱ号发酵液；3）培养菌的扩培：依次对步骤2）制得的ⅱ号发酵液进行试管培养、三角瓶深层培养和种子罐扩大培养，制得混合培养菌液；4）原料发酵：将步骤3）制得混合培养菌液加入步骤1）制得的刺梨果浆中，搅拌均匀并发酵18-30h后制得混合物；5）原料提取：将步骤4）制得的混合物放入至有机水溶剂中，其中混合物与有机水溶剂的体积比为1：7g/ml，进行恒温静置6h，得到混合溶液；6）超声处理：将步骤5）得到的混合溶液恒温超声处理30min后静置，然后再以超声波频率60hz进行超声提取处理90min，提取完成的溶液静置后得到超声静置液；7）离心处理：将步骤6）得到的超声静置液以离心转速为4500r/min，离心8min后得到的上层清液即为单宁酸溶液。
18.实施例4，本发明提供的一种刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法，其中有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.2-1.5:0.6-0.8的用量比制得的混合物，所述乙醇溶液的浓度为55-60%，所述丙酮的浓度为98.5-99.5%，进一步有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.2:0.7的用量比制得的混合物，刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法包括以下步骤：1）原料精选：将100公斤刺梨（单宁酸含量0.6%）清洗控水后破碎，制得刺梨果浆备用；2）制配培养基：所述培养基由葡萄糖4份、酵母粉1.5份、黄豆粉5份、玉米粉2份和消泡剂0.2份混合并加入饮用水配制而成；其次将培养基的ph调节至7.0后在110-120℃的条件下消毒25-30min，其次投入发酵罐中并加入复合酶制剂进行16-18h的发酵，制得ⅰ号发酵菌，然后向ⅰ号发酵菌加入0.03份的碳酸氢钙、0.1份的硫酸铵和0.03份的硫酸镁，最后按1.5%的比例向ⅰ号发酵菌中依次加入乳酸菌和醋酸菌的菌液，并进行26-28h的发酵，制得ⅱ号发酵液；3）培养菌的扩培：依次对步骤2）制得的ⅱ号发酵液进行试管培养、三角瓶深层培养和种子罐扩大培养，制得混合培养菌液；4）原料发酵：将步骤3）制得混合培养菌液加入步骤1）制得的刺梨果浆中，搅拌均匀并发酵18-30h后制得混合物；5）原料提取：将步骤4）制得的混合物放入至有机水溶剂中，其中混合物与有机水溶剂的体积比为1：7g/ml，进行恒温静置5h，得到混合溶液；6）超声处理：将步骤5）得到的混合溶液恒温超声处理30min后静置，然后再以超声波频率60hz进行超声提取处理90min，提取完成的溶液静置后得到超声静置液；7）离心处理：将步骤6）得到的超声静置液以离心转速为4500r/min，离心8min后得到的上层清液即为单宁酸溶液。
19.实施例5，本发明提供的一种刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法，其中有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.2-1.5:0.6-0.8的用量比制得的混合物，所述乙醇溶液的浓
度为55-60%，所述丙酮的浓度为98.5-99.5%，本技术优选有机水溶剂是由水、乙醇和丙酮按照1:1.2:0.9的用量比制得的混合物，刺梨发酵获得单宁酸的生产制备方法包括以下步骤：1）原料精选：将100公斤刺梨（单宁酸含量0.6%）清洗控水后破碎，制得刺梨果浆备用；2）制配培养基：所述培养基由葡萄糖4份、酵母粉1.5份、黄豆粉5份、玉米粉2份和消泡剂0.2份混合并加入饮用水配制而成；其次将培养基的ph调节至7.0后在110-120℃的条件下消毒25-30min，其次投入发酵罐中并加入复合酶制剂进行16-18h的发酵，制得ⅰ号发酵菌，然后向ⅰ号发酵菌加入0.03份的碳酸氢钙、0.1份的硫酸铵和0.03份的硫酸镁，最后按1.5%的比例向ⅰ号发酵菌中依次加入乳酸菌和醋酸菌的菌液，并进行26-28h的发酵，制得ⅱ号发酵液；3）培养菌的扩培：依次对步骤2）制得的ⅱ号发酵液进行试管培养、三角瓶深层培养和种子罐扩大培养，制得混合培养菌液；4）原料发酵：将步骤3）制得混合培养菌液加入步骤1）制得的刺梨果浆中，搅拌均匀并发酵18-30h后制得混合物；5）原料提取：将步骤4）制得的混合物放入至有机水溶剂中，其中混合物与有机水溶剂的体积比为1：7g/ml，进行恒温静置5h，得到混合溶液；6）超声处理：将步骤5）得到的混合溶液恒温超声处理25min后静置，然后再以超声波频率60hz进行超声提取处理90min，提取完成的溶液静置后得到超声静置液；7）离心处理：将步骤6）得到的超声静置液以离心转速为4500r/min，离心8min后得到的上层清液即为单宁酸溶液。
20.上述实施例1-5所述步骤4）中的单宁酸溶液先经过滤机进行超滤膜后浓缩，所述超滤膜采用膜孔径为30nm，孔密度为10/cm的中空纤维或卷式膜，超滤截留分子量为2500；所述单宁酸溶液常温常压下蒸发浓缩至原体积的1/5；其次进入热风循环干燥箱中进行喷雾干燥，再进入粉碎机中粉碎过筛得到单宁酸成品；其中实施例1得到单宁酸（医用级）0.57kg，单宁酸浓缩液纯度98.7%；实施例2得到单宁酸（医用级）0.52kg，单宁酸浓缩液纯度98.1%；实施例3得到单宁酸（医用级）0.46kg，单宁酸浓缩液纯度96.8%；实施例4得到单宁酸（医用级）0.48kg，单宁酸浓缩液纯度97.9%；实施例5得到单宁酸（医用级）0.43kg，单宁酸浓缩液纯度96.4%。
21.实验组1，与实施例1不同之处是所述步骤4）中的单宁酸溶液先经过滤机进行超滤膜后浓缩，所述超滤膜采用膜孔径为30nm，孔密度为10/cm的中空纤维或卷式膜，超滤截留分子量大于2500；所述单宁酸溶液常温常压下蒸发浓缩至原体积的1/5；其次进入热风循环干燥箱中进行喷雾干燥，再进入粉碎机中粉碎过筛得到单宁酸成品（医用级）0.49kg，单宁酸浓缩液纯度98.4%。
22.实验组2，与实施例1不同之处是所述步骤4）中的单宁酸溶液先经过滤机进行超滤膜后浓缩，所述超滤膜采用膜孔径为30nm，孔密度为10/cm的中空纤维或卷式膜，超滤截留分子量小于2500；所述单宁酸溶液常温常压下蒸发浓缩至原体积的1/5；其次进入热风循环干燥箱中进行喷雾干燥，再进入粉碎机中粉碎过筛得到单宁酸成品（医用级）0.50kg，单宁酸浓缩液纯度96.7%。
23.实验组3，与实施例1不同之处是所述步骤4）中的单宁酸溶液先经过滤机进行超滤膜后浓缩，所述超滤膜采用膜孔径为30nm，孔密度为10/cm的中空纤维或卷式膜，超滤截留分子量为2500；所述单宁酸溶液常温常压下蒸发浓缩至原体积的大于1/5；其次进入热风循环干燥箱中进行喷雾干燥，再进入粉碎机中粉碎过筛得到单宁酸成品（医用级）0.42kg，单宁酸浓缩液纯度92.6%。
24.实验组4，与实施例1不同之处是所述步骤4）中的单宁酸溶液先经过滤机进行超滤膜后浓缩，所述超滤膜采用膜孔径为30nm，孔密度为10/cm的中空纤维或卷式膜，超滤截留分子量为2500；所述单宁酸溶液常温常压下蒸发浓缩至原体积的小于1/5；其次进入热风循环干燥箱中进行喷雾干燥，再进入粉碎机中粉碎过筛得到单宁酸成品（医用级）0.47kg，单宁酸浓缩液纯度94.5%。
25.本技术中复合酶制剂选自纤维素酶、蛋白酶、葡萄糖酶和脂肪酶，上述步骤3）培养菌的扩培中依次对步骤2）制得的ⅱ号发酵液进行试管培养、三角瓶深层培养和种子罐扩大培养，制得混合培养菌液；其中试管培养是将ⅱ号发酵液置于具有液体培养基的试管中培养36h，培养结束后将试管置于82℃的水中水浴7-8min，随之将试管中的ⅱ号发酵液置于500ml种子培养基中，在温度为35℃厌氧条件下培养6h；三角瓶深层培养基是将经过种子培养基培养后的菌种按5%的接种量接入至5l三角瓶中继续培养6h；种子罐扩大培养是将三角瓶培养后的菌种按5%的接种量投入50l的种子罐中进行扩大培养；通过试验检测本技术菌种浓度为24
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10^8cfu/ml,从而有效提供混合培养菌液中的活菌数，使其与刺梨果浆接触，刺激刺梨果浆中有益物质的释放，从而便于后续刺梨中单宁酸的提取，再通过有机水溶剂的极性作用，利用单宁酸酚羟基与有机水溶剂氢基的结核性，将单宁酸从刺梨粉末中提取出来，再经超声和离心处理得到单宁酸溶液。
26.综上所述，本发明采用皮粉法(重量法)和分光光度法(紫外法)来测定样品中单宁酸的含量，采用上述技术方案按照单宁酸不同结构的提取方式可从刺梨中提取得到单倍体、双倍体和三倍体，本技术生产工艺简单，提取后的单宁酸浓缩液纯度高，提取出的单宁酸质地优良，从而提高了刺梨的利用率和利用价值，以及提高了刺梨的经济价值，本发明利用刺梨提取出的单宁酸在食品、化工和医学等领域具有显著的作用；单宁酸是从五倍子、塔拉等富含鞣质的植物样品中提取制备的由不同数目棓酰基和葡萄糖形成的酯的聚合物的一类天然多酚化合物；从化学成分上看单宁酸是由不同聚合度的棓酸的混合物，由于没食子酰基数目的不同导致化学组成结构复杂，再从化学组成上看，单宁酸是由不同数目棓酰基和葡萄糖形成的酯的聚合物的混合物，化学结构中通常含有1-7个(甚至更多)棓酰基基团。不同来源的单宁酸样品其化学组成也不尽相同，甚至差异较大；由于化学组成不同，导致其生物活性及其功能用途也不完全相同；按照本发明生产制备方法利用刺梨提取出的单宁酸在食品、化工和医学等领域具有显著的作用。
27.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
28.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包
含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。