一种抗Siglec-15单克隆抗体的制作方法

本发明涉及生物医药，特别涉及一种抗siglec-15单克隆抗体。

背景技术：

1、根据世界卫生组织iarc发布的《2020世界癌症报告》数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，癌症药物的研发尤为紧迫。

2、癌症细胞有时能够通过减低其表面上的肿瘤抗原表达而避免被免疫系统检测及破坏，使得免疫系统对其检测更为困难。同时，癌症细胞也可在其表面上表达诱导免疫细胞失活的蛋白质，或诱导周围环境中的细胞释放抑制免疫反应并促进肿瘤细胞增殖和存活的物质。随着抗pd-1抗体在肿瘤免疫治疗领域的巨大成功，如何改变肿瘤微环境，激活免疫系统对肿瘤的杀伤成为研究的热点。

3、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15(sialic acid-binding ig-like lectin15，siglec-15)，是siglec基因家族的一员，也是一种dap12相关免疫受体，属于免疫球蛋白超家族和唾液酸结合ig样凝集素家族。siglec家族分为两类:一类是序列保守的siglecs，包括唾液酸黏附素、cd22、mag和siglec-15；另一类是与cd33相关的序列可变的siglecs。siglecs是结合唾液酸的细胞表面蛋白，它们主要存在于免疫细胞表面，是i型凝集素的一个子集，在结构上具有非常典型和保守的结构特征，其穿膜区由2～17个胞外ig结构域组成，n端由一个结合唾液酸的v-set ig结构域和一定数目的c2-set ig结构域组成。大多数siglecs胞内段含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motifs，itams)，从而发挥免疫抑制功能；少数siglecs如siglec-14-16和siglec-h通过其跨膜区正电荷的精氨酸与itams的转化子dap12相结合发挥免疫调控作用。siglec-15由免疫球蛋白(ig)样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。siglec-15分为外源性和内源性两种。通常，外源性siglec-15高表达于肿瘤细胞表面，内源性siglec-15主要表达在巨噬细胞及树突状细胞表面，而在人和小鼠组织以及各种细胞类型中最低限度表达。研究发现，siglec-15具有抑制t细胞活性的功能，巨噬细胞表达的siglec-15可直接抑制人和小鼠t细胞的增殖和活性，并抑制ifn-γ和tnf-α的分泌；小鼠体内对siglec-15的基因敲除和抗体封闭，均可以增强微环境中的肿瘤免疫，抑制某些小鼠模型中的肿瘤生长。因此，siglec-15是一个全新的广泛存在于多种肿瘤中的免疫抑制分子，具有潜在的临床相关性。

4、目前现有的通过pd-1/pd-l1途径的肿瘤免疫疗法，只对约40％的患实体瘤的病人有效。在实际治疗过程中，当pd-l1上调时，许多其他分子和细胞机制会导致微环境中免疫功能削弱，这些机制包括缺少有效的免疫细胞浸润、缺少调节性t的富集、缺少肿瘤相关巨噬细胞，以及缺乏骨髓来源的抑制性细胞等，与此同时，pd-1疗法的成功，强调了修复免疫缺陷的重要性，并将其作为修复癌症免疫疗法中免疫系统正常化功能的重要准则。siglec-15虽与pd-l1具有一定的同源性，但是两者之间的表达没有关联性，且研发靶向siglec-15的药物是一种与抗pd-1药物互补的免疫检查点抗癌新药，所以，抗siglec-15单克隆抗体药物的研发具有重要的临床意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述问题，满足国内市场需求，本发明通过对免疫文库的筛选，得到了能够与siglec-15特异性结合，阻断siglec-15与细胞表面受体结合的抗siglec-15单克隆抗体。

2、本发明具体技术方案如下：

3、本发明提供了一种抗siglec-15单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用hcdr1、hcdr2和hcdr3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用lcdr1、lcdr2和lcdr3表示的轻链互补决定区，所述抗siglec-15单克隆抗体选自以下任意一种：

4、a-ⅰ：所述重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq id no:6所示；

5、a-ⅱ：所述重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:8所示，所述重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq id no:9所示，所述轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seq id no:10所示，所述轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:11所示，所述轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq idno:12所示；

6、a-ⅲ：所述重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:13所示，所述重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:14所示，所述重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq id no:15所示，所述轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seq id no:16所示，所述轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:17所示，所述轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq idno:18所示；

7、a-ⅳ：所述重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:19所示，所述重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:20所示，所述重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq id no:21所示，所述轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seq id no:22所示，所述轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:23所示，所述轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq idno:24所示。

8、进一步的，所述抗siglec-15单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子选自以下任意一种：

9、ma-ⅰ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:25所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:26所示；

10、ma-ⅱ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:27所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:28所示；

11、ma-ⅲ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:29所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:30所示；

12、ma-ⅳ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:31所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:32所示。

13、进一步的，所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为鼠的igg1型、igg2a型、igg2b型或igg3型的恒定区的一种，所述轻链恒定区为氨基酸序列如seq id no:33所示的鼠源ck型的恒定区，所述igg1型的恒定区的氨基酸序列如seq idno:34所示，所述igg2a型的恒定区的氨基酸序列如seq id no:35所示，所述igg2b型的恒定区的氨基酸序列如seq id no:36所示，所述igg3型的恒定区的氨基酸序列如seq id no:37所示。

14、进一步的，所述抗siglec-15单克隆抗体为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源化抗体恒定区。

15、进一步的，所述抗siglec-15单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：

16、ha-ⅰ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:42所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:43所示；

17、ha-ⅱ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:42所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:44所示。

18、进一步的，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体恒定区。

19、进一步的，所述人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体重链恒定区为人的igg1型、igg2型或igg4型的恒定区的一种，所述igg1型的恒定区的氨基酸序列如seq id no:38所示，所述igg2型的恒定区的氨基酸序列如seq id no:39所示，所述igg4型的恒定区的氨基酸序列如seq id no:40所示，所述人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如seq idno:41所示的人ck型的恒定区。

20、进一步的，所述人源化抗体分子为全长抗体或抗体片段，所述人源化抗体分子包括fab、f(ab)2、fv或scfv中的一种或几种组合。

21、本发明还提供了一种蛋白，其包含所述的抗siglec-15单克隆抗体。

22、本发明还提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码所述的抗siglec-15单克隆抗体。

23、本发明还提供了一种重组dna表达载体，所述重组dna表达载体包含所述的多核苷酸分子。

24、本发明还提供了一种转染所述的重组dna表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

25、优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为hek293细胞、cho细胞或ns0细胞。

26、本发明还提供了一种药物，所述药物包含所述的抗siglec-15单克隆抗体。

27、本发明还提供了所述的抗siglec-15单克隆抗体在制备治疗免疫性疾病或癌症药物中的应用；

28、优选的，所述癌症包括脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌、淋巴癌或白血病；

29、所述免疫性疾病包括银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎或自身免疫性肝炎。

30、本发明进一步的还提供了所述的抗siglec-15单克隆抗体与抗pd-1单克隆抗体联合用于治疗癌症或免疫性疾病药物中的应用。

31、本发明的有益效果如下：本发明提供的抗siglec-15单克隆抗体能够与siglec-15特异性结合，阻断siglec-15与细胞表面受体的结合，抑制胞内信号通路的传导，并达到抑制肿瘤生长的作用，用于治疗癌症或免疫性疾病，癌症包括但不限于脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌、淋巴癌或白血病等，免疫性疾病包括但不限于银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎等。