鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备

本发明涉及基因工程，特别是鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备。

背景技术：

1、鱼类诺卡氏菌病(fish nocardiosis)是一种由诺卡氏菌引起的、发生在多种经济养殖鱼类的慢性感染病。近年来鱼类诺卡氏菌病的流行，给养殖户带来极大困扰。该病的病原菌可以通过鱼体的伤口或鱼鳃以及食物饲料等进行感染，感染诺卡氏菌病的杂交鳢(channa maculate♀×channa argus♂)早期无明显病症，病情隐性缓慢发展，一旦感染后期治疗困难，病死率高。典型的疾病特征包括肾脏、脾脏、心脏、鳃和肝脏出现肉芽肿结节，伴有多发性皮肤溃疡。鱼类诺卡氏菌病的致病菌主要有三种，其中鰤鱼诺卡氏菌(nocardiaseriolae)近年来的感染案例最多。该菌是一种机会致病菌，容易使免疫力低下的鱼类患病。鰤鱼诺卡氏菌感染已在40多种鱼类中报道，其所引起的诺卡氏菌病日益严重，给全球的淡水和海洋养殖系统造成越来越严重的损害。

2、现研究发现鱼体对环境刺激的反应有多种方式，包括调节基因表达以优化其在特定环境中的生存能力。这一原理也适用于病原体，病原体在感染宿主期间诱导或抑制特定基因以优化改善自身在宿主体内寄生环境中的生长情况。在感染期间病原体体内特异性诱导的基因可能与宿主的致病性有关，并且可能是该病原菌感染宿主的毒力因子。前期研究，开发了几种技术来帮助识别和筛选病原菌在感染宿主期间自身特异表达的细菌基因，体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology，iviat)就是其中一种新的、快速且相对简单的体内抗原诱导技术。

3、iviat技术是一种免疫学技术，可以帮助识别在宿主感染期间特异性表达的免疫原性抗原。因此，它允许在体外生长期间检测细菌不表达的蛋白质中的免疫原性表位。入侵宿主的细菌可以感知体内环境，并通过诱导或抑制特定基因的表达进行适应。就病原体而言，与体外条件相比，鉴定体内表达上调的基因可能有助于深入了解与细菌毒力相关的基因。iviat技术通过收集感染动物的抗血清与病原菌基因组文库免疫杂交筛选出病原体在宿主体内表达抗原。目前，iviat技术已应用于多种动物病原菌中，病原宿主包括鼠、猪、鸡、鸭、羊等，但很少有研究将该技术应用于鱼类病原体。同时大量的研究表明，利用iviat技术，通过收集感染动物的抗血清与病原菌基因组文库免疫杂交筛选出病原体在宿主体内表达的体内诱生抗原和体内诱导基因，是诊断试剂研发、靶向药物设计和高效疫苗制备的最佳候选抗原或基因。

4、鰤鱼诺卡氏菌是一种机会致病菌，潜伏期较长，往往发病初期症状不明显，当出现病症时就已经无法控制，所以对于鰤鱼诺卡氏菌病预防十分重要。目前诺卡氏菌病的防治尚未取得良好效果，大多数还是药物防治。疫苗免疫是防控该病的有效方法，因此研制高效、安全、环保的疫苗十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备。

2、为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

3、本发明第一个目的是要提供鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因，所述鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因为is701 family transposase、molybdopterin-dependent oxidoreductase、membrane protein insertase yidc(yidc)、phosphoketolase family protein、ergothioneine biosynthesis glutamate-cysteineligase egta(egta)和hypothetical protein 6747基因，所述鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因的核酸序列和氨基酸序列如序列表分别如seq id no.1至seq id no.6所示。

4、本发明第二个目的是要提供鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因的筛选方法，包括以下步骤：

5、s1、鰤鱼诺卡氏菌基因组表达文库的构建

6、以1μl、0.5u/μl sau3a i酶切鰤鱼诺卡氏菌基因组，随后用5μl、10u/μl的bamhⅰ内切酶对三种用于构建文库的原核表达载体pet-30a/b/c进行37℃水浴酶切并去磷酸化，利用350u/μl的t4 dna ligase连接酶，将回收的1-4kb基因组酶切片段与pet-30a/b/c原核表达载体连接并转化到大肠杆菌dh5ɑ感受态细胞中，最后把重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，稀释后涂布于含100μg/ml的kana+抗生素lb平板，37℃培养24h；利用pet30 a/b/c原核表达载体的特异性引物t7/t7t序列，在鰤鱼诺卡氏菌基因组文库中随机挑取22个大肠杆菌bl21(de3)重组克隆菌落，用pet30 a/b/c原核表达载体的特异性引物对其进行菌落pcr鉴定，分析酶切片段插入率和大小；

7、s2、杂交鳢感染鰤鱼诺卡氏菌血清的制备

8、用100μl、菌落数1×105cfu/ml的鰤鱼诺卡氏菌菌液攻毒杂交鳢7d、15d、30d各取一次血，30d后再次攻毒，隔三天取一次血，共三次；分离血清，将采集的各感染期的血清等体积混合，分装备用；用从培养基收集的鰤鱼诺卡氏菌全菌及其超声破碎处理后的菌体裂解物、和不含基因组文库的大肠杆菌超声破碎处理后的裂解物充分吸收处理血清，以去除鰤鱼诺卡氏菌在宿主体外生存表达的蛋白抗原刺激杂交鳢引起鱼体产生的抗体，获取仅有鰤鱼诺卡氏菌在杂交鳢体内表达的抗原刺激杂交鳢鱼体产生的抗体血清；

9、s3、鰤鱼诺卡氏菌基因组表达文库的免疫筛选

10、用从培养基收集的鰤鱼诺卡氏菌全菌及其超声破碎处理后的菌体裂解物、和不含基因组文库的大肠杆菌超声破碎处理后的裂解物充分吸收处理血清，对鰤鱼诺卡氏菌基因组表达文库进行初步筛选：用无菌棉签将初次筛选的阳性菌落均匀分布接种在含有50μg/ml的kana+抗生素的lb培养基平板上培养，37℃过夜培养，重复初筛步骤过程；收集保存第一次复筛的阳性克隆菌落，用无菌棉签将第一次复筛筛选的阳性菌落均匀分布接种在新的含有50μg/ml的kana+抗生素的lb培养基平板上培养，37℃过夜培养；重复初筛复筛步骤过程，最终得到31个阳性克隆菌落；用pet-30a/b/c原核表达载体的特异性引物t7/t7t序列扩增阳性克隆菌落进行菌落pcr反应经产物测序后，利用primer premier5.0软件设计特异性引物，以鰤鱼诺卡氏菌rna反转录合成的cdna为模板，检测阳性克隆是否在体外表达，最后获得六个在体外不表达的阳性克隆，分别为is701 family transposase、molybdopterin-dependent oxidoreductase、yidc、phosphoketolase family protein、egta和hypothetical protein 6747基因。

11、本发明第三个目的是要提供利用鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因构建的基于体内诱生抗原的诺卡氏菌病疫苗。

12、本发明第四个目的是要提供基于体内诱生抗原的诺卡氏菌病疫苗的制备方法，包括以下步骤：

13、(1)构建鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因真核表达重组质粒；

14、(2)将构建好的鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因真核表达重组质粒中的一种和空载质粒菌种pcdna3.1-myc-his-a分别接种于含50μg/ml的kana+抗生素lb液体培养基中，37℃水平振荡摇床180r/min过夜培养，待菌液培养至生长指数期时将菌液加入多管50ml离心管中，离心收集菌体；使用无内毒素质粒大量提取试剂盒大量提取去内毒素真核重组表达质粒，将提取好的无内毒素质粒用稀释液稀释成浓度为250μg/ml，即得is701family transposase、molybdopterin-dependent oxidoreductase、membrane proteininsertase(yidc)、phosphoketolase family protein、ergothioneine biosynthesisglutamate-cysteine ligase egta(egta)和hypothetical protein 6747基因疫苗。

15、具体地，鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因真核表达重组质粒构建的具体步骤如下：

16、从鰤鱼诺卡氏菌zj0503菌株全基因组序列信息中，寻找is701 familytransposase、molybdopterin-dependent oxidoreductase、membrane protein insertase(yidc)、phosphoketolase family protein、ergothioneine biosynthesis glutamate-cysteine ligase egta(egta)和hypothetical protein 6747基因的序列，设计引物：

17、

18、分别进行基因克隆；然后分别结合真核表达载体pcdna3.1-myc-his-a，设计带有同源臂的引物：

19、

20、，利用同源重组的方法构建is701 family transposase、molybdopterin-dependent oxidoreductase、membrane protein insertase(yidc)、phosphoketolasefamily protein、ergothioneine biosynthesis glutamate-cysteine ligase egta(egta)和hypothetical protein 6747基因的真核表达重组质粒。

21、与现有技术相比，本发明利用iviat技术获得六个鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因，利用同源重组的方法构建六个基因的真核表达重组质粒，然后去内毒素制成dna疫苗，对杂交鳢防治诺卡氏菌病具有一定的免疫保护效果。本发明具有成产成本低廉、易于组成多价疫苗、可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫、安全性较好等优点，能进一步促进鰤鱼诺卡氏菌致病机制的理解，在建立筛选鰤鱼诺卡氏菌疫苗抗原候选分子的新途径中具有良好的应用。