一种磁珠偶联因子复合物及扩增NK细胞的方法与流程

本发明属于生物免疫学，具体涉及一种磁珠偶联因子复合物及扩增nk细胞的方法。

背景技术：

1、研究表明自然杀伤(natural killer，nk)细胞能诱导有效的抗肿瘤、抗感染免疫反应，无需预先刺激，通过使用穿孔素和颗粒酶以及其它机制，无mhc限制性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞。异体nk细胞移植几乎不会导致移植物抗宿主病(gvhd)和细胞因子风暴(crs)，有望成为一种“现货型”的产品。根据clinicaltrials数据库显示，截止2022年9月19日，全球范围内nk细胞免疫疗法相关的临床试验有397例正在进展中，临床结果显示，nk疗法治疗复发或难治性非霍奇金淋巴瘤患者，大多数产生了临床缓解，且未出现主要的毒性作用。

2、但是nk细胞在外周血中比例小，体外扩增难，扩增后细胞毒活性弱，都是限制其应用于临床免疫治疗的瓶颈。现有的nk细胞制备方法主要有饲养层法、因子法。饲养层法主要使用辐照后的k562细胞，或者工程化改造k562细胞，激活及扩增效果较好，但具有潜在的风险，安全性低。因子法没有外源风险因素加入，安全性较好，但需要预先包被，操作繁琐，激活和扩增nk细胞效果由于样本差异不稳定。

3、中国专利文献cn107354133a(申请号：201710767822.6)公开了磁珠偶联多种刺激蛋白的体外扩增nk细胞的方法及应用。主要为加入偶联了il-15、4-1bbligand和il-21的磁珠(三者摩尔比为1～3:1～3:1～3)，体外扩增nk细胞。

4、中国专利文献cn113755436a(申请号：202110784595.4)公开了一种体外nk细胞的扩增方法及其nk细胞。主要为采用含有偶联蛋白磁性微球上偶联有il15、il18、cd86、cd137l、mica中的至少一种。该发明将nk细胞生长所需要的多个激活及扩增信号蛋白分子偶联到磁性微球表面，使用偶联蛋白磁性微球进行nk细胞的体外扩增培养。

5、现有技术中虽然已有关于磁珠与因子偶联扩增nk细胞的研究报道，但是具体方法和效果与本发明有明显差异。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明公开了一种磁珠偶联因子复合物及扩增nk细胞的方法。

2、本发明避免了nk细胞与其它来源细胞共培养的问题，在降低风险的基础上还可以获得大量高纯度高功能的nk细胞。

3、本发明的目的是采用新颖的方法获得高效扩增的nk细胞，具有良好的安全性和稳定性，操作简单。

4、本发明的技术方案如下：

5、一种磁珠偶联因子复合物，包括磁珠、4-1bbl，il21，mica。

6、根据本发明优选的，磁珠粒径为300nm-4.5um。

7、进一步优选的，磁珠粒径为300nm。

8、上述磁珠偶联因子复合物的制备方法，包括如下步骤：

9、①将4-1bbl、il21、mica生长因子分别置于0.1-0.5m硼酸缓冲液中，制得生长因子溶液，将生长因子溶液与磁珠混合孵育，4℃以下旋转混匀16-24h，孵育结束后，在无菌条件下置于磁性条件下静置，弃去上清液，然后用封闭液洗涤后，再用封闭液重悬，4℃以下旋转混匀16-24h，制得各单一生长因子磁珠组合物，分别为磁珠偶联4-1bbl组合物、磁珠偶联il21组合物、磁珠偶联mica组合物；

10、②将磁珠偶联4-1bbl组合物：磁珠偶联il21组合物：磁珠偶联mica组合物以磁珠数量计(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)的比例混合，制备获得磁珠偶联因子复合物。

11、根据本发明优选的，步骤①中，在无菌条件下置于磁性分离器上静置。

12、进一步优选的，静置1-2min。

13、根据本发明优选的，步骤①中，封闭液的组成以每升计为：体积分数为3％人ab血清，2mm edta，0.1g叠氮化钠，余量的d-pbs缓冲液。

14、根据本发明优选的，步骤①中，生长因子溶液与磁珠混合比例按体积比(5-10)：100，生长因子的浓度为0.05-1mg/ml。

15、上述磁珠偶联因子复合物在制备nk细胞中的应用。

16、利用上述磁珠偶联因子复合物制备nk细胞的方法，包括如下步骤：

17、将外周血单个核细胞接种于培养基，接种后培养基中的细胞密度为(1-3)x106个/ml，并加入磁珠偶联因子复合物，加入量按磁珠与细胞的数量比计为(1-2)：1，培养至第6-9天时，加入磁珠偶联因子复合物，加入量按磁珠与细胞的数量比计为(4-8)：1，继续培养至收获nk细胞，并通过磁性吸附去除nk细胞中的磁珠偶联因子复合物。

18、根据本发明优选的，培养基为gt-t551 h3培养基。

19、根据本发明优选的，继续培养7-9天，收获nk细胞。

20、根据本发明优选的，通过磁性分离器吸附去除nk细胞中的磁珠偶联因子复合物。

21、有益效果

22、1、本发明提供的磁珠偶联因子复合物，能够富集在细胞团周围，持续作用，对nk细胞的激活和扩增作用更优，并有效避免了nk细胞的污染，更为安全，并且本发明提供的磁珠偶联因子复合物不需要预先包被，可直接加入培养基中激活和扩增nk细胞，整个过程简单且高效。

23、2、本发明制备的nk细胞扩增倍数、nk阳性率，作用效果更优。

技术特征：

1.一种磁珠偶联因子复合物，其特征在于，包括磁珠、4-1bbl，il21，mica。

2.如权利要求1所述复合物，其特征在于，磁珠粒径为300nm-4.5um；

3.权利要求1-2任一项所述磁珠偶联因子复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤①中，在无菌条件下置于磁性分离器上静置；

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤①中，封闭液的组成以每升计为：体积分数为3％人ab血清，2mm edta，0.1g叠氮化钠，余量的d-pbs缓冲液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中，生长因子溶液与磁珠混合比例按体积比(5-10)：100，生长因子的浓度为0.05-1mg/ml。

7.权利要求1-2任一项所述磁珠偶联因子复合物在制备nk细胞中的应用。

8.利用权利要求1-2任一项所述磁珠偶联因子复合物制备nk细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，培养基为gt-t551 h3培养基。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，继续培养7-9天，收获nk细胞；

技术总结
本发明提供了一种磁珠偶联因子复合物及扩增NK细胞的方法，属于生物免疫学技术领域，具体为一种磁珠偶联因子复合物，包括磁珠、4‑1BBL，IL21，MICA；磁珠偶联因子复合物在制备NK细胞中的应用及扩增NK细胞的方法；本发明提供的磁珠偶联因子复合物，能够富集在细胞团周围，持续作用，对NK细胞的激活和扩增作用更优，本发明制备的NK细胞扩增倍数、NK阳性率，作用效果更优。

技术研发人员：王芝辉,徐娟,曹启龙,梁少帅,董友玉,张文茜
受保护的技术使用者：青岛海尔生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12