一种用于治疗心脏衰竭的药物组合物的制作方法

1.本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种用于治疗心脏衰竭的药物组合物。


背景技术：

2.据统计，人群中心衰的患病率约为1.5％～2.0％，65岁以上人群可达6％～10％。且在过去的40年中，由心衰导致死亡增加了6倍。作为一个人口大国，我国人群慢性心衰的流行病学结果显示，随机抽样调查35～74岁城乡居民共15518人，心衰患病率为0.9％；其中男性为0.7％，女性为1.0％，女性患病率高于男性，不同于西方国家的男性高于女性。这种差异可能和我国风湿性瓣膜病心衰发病率较高有关，而后者多见于女性。35～44岁、45～54岁、55～64岁、65～74岁年龄组的心衰患病分别为0.4％、1.0％、1.3％和1.3％；随着年龄增高，心衰的患病率显著上升(p&lt；0.01)。城市人群心衰患病率为1.1％,农村为0.8％，城市高于农村。我国北方地区心衰患病率1.4％；南方地区为0.5％,北方地区明显高于南方。这种城乡比例和地区分布，正是与冠心病和高血压的地区分布相一致。
3.心衰治疗的药物各年段均以利尿剂、硝酸酯类和洋地黄类为主，其中洋地黄的使用有下降趋势，中国部分地区硝酸酯类的使用还有上升趋势，2000年占 53.0％；而上海地区则占74.4％。上海市2000年门诊心衰病例1次性横断面调查研究，用药情况与上述相似，硝酸酯类亦高达77.5％。上海市住院心衰病例的调查发现，硝酸酯类除少数兼用于心肌缺血治疗外，主要是以心力衰竭治疗为目的。至于acei和β-受体阻滞剂的应用虽有上升趋势，但与治疗指南仍有差距。2000年acei使用率，中国部分地区与上海地区各为40.4％与70.8％，以上海地区增长迅速。β受体阻滞剂使用率中国部分地区与上海地区各为19％与25％。令人惊异的是，硝酸酯类的应用却是如此的的广泛。早年虽有硝酸酯并肼屈嗪联合应用有利于慢性心衰的报道(vheftⅰ试验)，但以后的v
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heftⅱ试验示能证实。迄今为止，亦无其他证据表明单用硝酸酯类治疗慢性心衰有益，硝酸酯类又极易产生耐药性，因此不宜用于慢性心衰的长期治疗，可以短期应用以缓解症状。关于慢性心衰的非药物治疗，国内已有报道。双心室同步起搏治疗慢性心衰伴室内传导延迟的患者，国内已有98例报道，其中北京阜外医院占56例；香港大学玛丽医院占20例。心功能分级均为ⅲ、ⅳ级。qrs时限均&gt；0.12s。随访时间从术后3～7天到3个月、7个月、 12个月和平共处五项原则个月不等。结果都能改善临床症状、lvef升高、6 分步行距离增加，左心室收缩末容积和舒张末容积缩小。香港地区的报道表明，疗效为起搏依赖性，停止起搏1个月后，各指标均有不同程度的下降。上述研究资料提示，对心功能为nyhaⅲ级或ⅳ级伴有室内传导阻滞的心衰患者，同步化双心室起搏能逆转左室重塑，改善心功能。另有报道，应用心房心室顺序起搏的生理型起搏器(ddd)治疗晚期慢性心衰18例，av间期调短至 100～150ms；起搏器频率调整至90～120次/min。对照组18例，仅用药物治疗。结果显示，两组的生存时间、病死率、心功能分级和lvef、左室舒张末径缩小值均有显著差异，治疗组显著优于对照组。2002年1月公布了《慢性收缩性心力衰竭治疗建议》，这是第一个遵循循证医学原则撰写的“建议”。首先，强调了心衰治疗概念的根本性转变。对具体每一类药物，首先阐述这类药物在心肌重塑中的作用，而不是
药理作用和急性血液动力学变化。其次是临床试验的结果，必需病例数在100例以上、随访时间6个月以上，严格的随机、对照、双盲、有事先设定的硬终点和足够的统计把握度者才予纳入。然后是临床应用，要求切合临床实践、具体、明确。《指南》或《建议》的作用就是将临床试验的结果应用于临床实践。在过去10年中，心力衰竭临床试验的死亡率已下降了 46％，因此，目前最重要的就是，尽早地将《建议》应用于临床实践。
4.随着医疗技术的不断提高，在临床上对慢性心力衰竭的治疗药物也由传统的单纯性的血管扩张剂逐渐转变为以血管紧张素转换酶抑制剂为代表的新型临床药物。当然开发其他的药物用于心力衰竭的治疗也是研究的重点方向。
5.研究表明，在血管紧张素
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(ang
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)诱导的急性高血压和心肌损伤/纤维化重塑的小鼠模型中，发现经ang
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处理的小鼠心脏血管周围c3a、c3b和 c5a显著沉积以及c5a受体(c5ar)表达增加，小鼠心肌中还出现了大量 cd45+t细胞，这表明c5ar表达增加与单核/巨噬细胞浸润有关；并且c5ar 缺失而非c3a受体(c3ar)缺失的小鼠在输注ang
‑ⅱ
后心脏重构和炎症明显减轻。这提示补体在高血压性心脏中被激活，c5ar缺失对心脏重塑有明显的保护作用，c5ar缺失主要通过阻止c5a与其结合减少炎症因子及趋化因子分泌，减少ang
‑ⅱ
介导的心脏炎症和重塑。通过将c5ar敲除能够保护小鼠心功能并抑制纤维化。这也提示了通过c5ar靶点能够开发用于治疗心力衰竭的药物。
6.抗体是较好的抑制c5ar和c5a互相作用的抑制剂。抗体和c5a结合，阻止c5a和受体作用，发挥其效应。在早期主要是一些多克隆的抗血清，后来制备针对c5a上表位的特异的单克隆抗体，在多种动物炎性疾病模型中发现其有抗炎的作用，对于抗c5a抗体主要针对c5a的三个不同位置氨基木端(a，残基1-16)，中间区域(m，残基17-36)，羧基末端(c，残基58-77)的表位。对于csa对白细胞趋化性抑制性发现anti-c》anti-m》》anti-a，前两类抗体具有保护性作用。单克隆抗体137-26为lgg1类抗体。该抗体和c5ar竞争性与c5a 结合，抑制csa介导的中性粒细胞趋化现象。单克隆抗体137-26可以和人cs 的c5a部分结合且压制c5a的效应但不干扰c5的裂解及后继的溶菌性c5b-9 复合体的形成。单克隆抗体137-26和固相及液相c5a,c5ar高亲和性的浓度依赖性反应并且该抗体有效地终止了补体依赖的e.coli介导的cd11b上调和人全血中性粒细胞氧化突发。但是目前，针对c5ar的单克隆抗体的研究还不够多，提供的可选形式基本没有。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种特异性针对c5ar靶点的抑制剂。
8.进一步的，本发明提供了一种特异性针对c5ar的单克隆抗体3f11。
9.进一步的，本发明的c5ar的单克隆抗体经过轻重链可变区序列鉴定，获得了其轻链可变区序列如seq id no：1所示，其重链可变区序列如seq idno：1所示。
10.进一步的，本发明还提供一种用于治疗心脏衰竭的的药物组合物，所述药物组合物中含有c5ar的单克隆抗体，该抗体其轻链可变区序列如seq idno：1所示，其重链可变区序列如seq id no：1所示。
11.进一步的，本发明还提供一种用于治疗心肌纤维化的的药物组合物，所述药物组合物中含有c5ar的单克隆抗体，该抗体其轻链可变区序列如seq idno：1所示，其重链可变区序列如seq id no：1所示。
12.进一步的，本发明提供了c5ar的单克隆抗体在制备治疗心脏衰竭的的药物组合物中的用途，所述抗体其轻链可变区序列如seq id no：1所示，其重链可变区序列如seq id no：1所示。
13.进一步的，本发明提供了c5ar的单克隆抗体在制备治疗心肌纤维化的的药物组合物中的用途，所述抗体其轻链可变区序列如seq id no：1所示，其重链可变区序列如seq id no：1所示。
14.进一步的，本发明的药物组合物还含有药学上可接受的载体。
15.该药物组合物可以采用以下形式：滴剂、混悬剂、纳米混悬剂、软膏、乳膏、可生物降解的剂型诸如可吸收凝胶、海绵剂或胶原(collagen)、不可生物降解的剂型诸如(例如硅酮)植入剂、薄膜(wafer)、透镜，以及微粒或泡囊系统诸如泡囊(niosome)、乳剂或微乳剂等。
16.适合的药学上可接受的聚合物的实例包括但不限于纤维素衍生物(例如羟丙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素聚合物、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧亚甲基羟乙基纤维素和羧甲基羟乙基纤维素或它们的任意组合、丙烯酸酯类(例如丙烯酸、丙烯酰胺和马来酸酐聚合物、共聚物或它们的混合物)，以及它们的混合物。也可以使用聚合物共混物。优选的药学上可接受的聚合物为羟乙基纤维素。在一个实施方案中，所述药学上可接受的聚合物的存在量为约0.01％至约5.0％(重量/体积)，优选约0.05％至约2％(重量/ 体积)，更优选约0.1％至约1.0％(重量/体积)，例如约0.1％、0.2％、0.5％或 1.0％(重量/体积)。
17.适合的药学上可接受的润湿剂或表面活性剂的实例包括但不限于两性、非离子型、阳离子型或阴离子型分子。适合的表面活性剂包括但不限于聚山梨酯、十二烷基硫酸钠(月桂基硫酸钠)、十二烷基二甲基氧化胺、多库酯钠、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯脱水山梨醇、辛苯昔醇、 n,n-二甲基十二烷基胺-n-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵、聚氧乙烯(10)月桂醚、表面活性剂(由月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇衍生的植物油系脂肪醇聚氧乙烯醚)、胆盐(例如脱氧胆酸钠和胆酸钠)、聚氧乙烯蓖麻油、壬基酚乙氧基化物、环糊精、卵磷脂、甲苄索氯铵、羧酸盐、磺酸盐、石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、硫酸盐、硫酸化天然油和脂肪、硫酸化酯、硫酸化烷醇酰胺、烷基酚(乙氧基化和硫酸化的)、乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙二醇酯、脱水山梨醇酯及其乙氧基化衍生物、脂肪酸乙二醇酯、羧酰胺、单烷醇胺缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酰胺、季铵盐、具有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯脂环族胺、n,n,n,n-四取代乙二胺、2-烷基-1-羟乙基-2-咪唑啉、n-椰油基-3-氨基丙酸/钠盐(n-coco 3
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aminopropionic acid/sodium salt)、n-牛脂基-3-亚氨基二丙酸二钠盐(n-tallow 3
‑ꢀ
iminodipropionate disodium salt)、n-羧甲基-n,n-二甲基-n-9-十八烯基氢氧化铵 (n-carboxymethyl n dimethyl n-9octadecenyl ammonium hydroxide)、n-椰油酰胺乙基-n-羟乙基甘氨酸钠盐等、聚氧乙烯、脱水山梨醇单月桂酸酯和硬脂酸酯、 (聚乙氧基化蓖麻油)、(环氧乙烷/12-羟基硬脂酸)、聚山梨酯、四丁酚醛，以及它们的任意组合。优选的药学上可接受的表面活性剂包括四丁酚醛和(脱水山梨醇单油酸酯)或其混合物。在一个实施方案中，所述药学上可接受的润湿剂或表面活性剂的存在量为约0.01％至约5.0％(重量/体积)，优选约0.05％至约 2.0％(重量/体积)，更优选约0.1％至约1.0％(重量/体积)，例如
约
18.0.1％、0.2％、0.5％、1.0％(重量/体积)。
19.适合的药学上可接受的ph调节剂的实例包括但不限于氢氧化钠、柠檬酸、盐酸、硼酸、乙酸、磷酸、琥珀酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氧化镁、碳酸钙、碳酸镁、硅酸铝镁、苹果酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠、乳酸、葡糖酸、酒石酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸、富马酸、二乙醇胺、单乙醇胺、碳酸钠、碳酸氢钠、三乙醇胺或它们的任意组合。在一个实施方案中，所述药学上可接受的ph调节剂的存在量为约0.01％至约2.0％(重量/体积)，优选约0.05％至约 1％(重量/体积)。
20.有益效果
21.本发明以c5ar为免疫原通过免疫小鼠制备获得了特异性的c5ar单克隆抗体，所述抗体能够高活性的结合识别c5ar以及识别c5ar+细胞，并且能够有效的抑制识别c5ar和c5a的结合。通过小鼠心力衰竭模型实验证实了所述的单克隆抗体能够有效的治疗所述疾病能够有效的减少心肌纤维化，具有很好的治疗效果。
附图说明
22.图1各组心肌纤维沉积面积的结果图
具体实施方式
23.以下实施例的目的仅为对本发明进行说明，而不是旨在以任何方式限制本发明的范围。
24.实施例1c5ar单克隆抗体的制备
25.免疫抗原的制备：根据人和小鼠的c5ar的序列，通过iedb分析方法，通过亲水性、柔韧性以及免疫原性和结构分析，选择二者的高免疫表位以及二者的共同保守区域，筛选获得了特异性的免疫抗原肽：
26.slillnmyasilllatisadrfllvfkpiw，将所述抗原肽委托上海生工进行合成。随后所述多肽偶联血蓝蛋白(klh)作为免疫抗原。
27.将免疫抗原经皮下多点注射免疫6周龄雌性balb/c小鼠，100μg/只，每次间隔2周，共免疫3次。第1次加等量的弗氏完全佐剂乳化，后2次加等量的弗氏不完全佐剂乳化，并于免疫后2周尾静脉采血，分离血清，elisa检测抗体效价，选择其中效价最高的3号小鼠于融合前第3天，腹腔注射100μg免疫原作为加强免疫。
28.按照常规方法，将脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞以6:1混匀，peg1450作为融合剂，接种于含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，100μl/孔。融合后的第3天换用hat培养液继续培养；第7、10天换用ht培养液培养；第15天用间接elisa方法检测细胞上清，以未免疫小鼠血清作为阴性对照，将阳性杂交瘤细胞按照有限稀释法进行亚克隆，连续克隆4次，直至杂交瘤细胞生长孔的抗体阳性率为100％。最终获得4株能够稳定分泌抗c5ar单克隆抗体，分别是2b05，5d11，2f4，3f11。
29.实施例2 3f11单克隆抗体效价及亚型鉴定
30.将500μl液体石蜡腹腔注射致敏8周龄balb/c小鼠，10周后腹腔注入适量3f11杂交瘤细胞，待小鼠腹部极度膨胀时收集腹水，1000
×
g离心10min 去除红细胞等杂质，上清分
装后于-70℃保存备用。
31.将腹水以原液为起点倍比稀释，用间接elisa方法测定其效价，并设立阴阳性血清对照。结果显示3f11单抗的腹水效价为1:4
×
106。
32.使用mcab亚类鉴定试剂盒鉴定所获得抗体的亚型，具体方法参照使用说明进行。结果显示，所获得的3f11单克隆抗体为igg1亚类，轻链为κ链。
33.实施例3 3f11单克隆抗体特异性鉴定
34.将抗原肽、bsa、血蓝蛋白、c3ar重组蛋白进行sds-page电泳，然后转印nc膜，以3f11单克隆抗体作为一抗，以hrp标记的山羊抗小鼠igg作为二抗，使用增强型dab显色液显色，判定结果。结果显示，3f11单克隆抗体只能特异性的与抗原肽结合，而不与bsa、血蓝蛋白和c3ar重组蛋白结合，表现了较好的特异性。
35.实施例4 3f11单克隆抗体亲和力鉴定
36.免疫原按照常规包被浓度2ug/ml进行包被，包被96孔板每孔50μl，37℃温育2小时或者4℃反应过夜；2％bsa或者5％的脱脂牛奶封闭液200μl/孔， 37℃温育1小时或4℃反应过夜，tbst洗4遍；一抗：将纯化后的3f11单克隆抗体按一定比例稀释后加入到96孔板中，同时加对应体积的pbs，50μl/孔，尽量不要打出泡沫，且添加均匀，微型振荡器上振荡，让液相混合更均匀， 37℃温育1小时；二抗：一抗孵育后tbst洗4遍，加入酶标二抗，100μl/孔， 37℃温育1小时；显色：二抗孵育后tbst洗4遍，加底物溶液100μl/孔，37℃恒温箱放置5～10min；终止反应、比色：加30μl/孔终止液，颜色变黄后，使用酶标仪测定450nm的吸光值。采用beatty所建立的非竞争elisa法， spss15.0统计软件，以mab浓度为x轴，od值为y轴，经曲线回归分析中的curveestimation过程拟合结合反应曲线模型及其方程。再将od50值代入曲线方程，计算相对应的抗体浓度。beatty所推导的公式:k＝(n-1)/2(n[ab]’t-[ab] t)，计算亲和常数。结果显示，3f11单克隆抗体亲和常数为
[0037]
k＝6.8
×
10
10
mol/l，本发明属于高亲和力抗体。
[0038]
实施例5 3f11单克隆抗体识别c5ar+细胞实验
[0039]
将u937细胞、人脐静脉内皮细胞vec和pmn细胞培养在酶联板中，调整细胞数为105/孔，以同浓度的sp2/0细胞为对照，取3f11单克隆抗体按照 1:4000的工作浓度进行elisa测定，结果如表1所示。
[0040]
表1单抗识别的细胞种类
[0041][0042][0043]
从表1的结果可以看出，3f11单克隆抗体识别c5ar+细胞u937细胞、人脐静脉内皮
细胞vec和pmn细胞，而不识别对照sp2/0细胞，具有较好的特异性。
[0044]
实施例6 3f11单克隆抗体中和抑制实验
[0045]
mpo为pmn细胞所特有，pvec粘附pmn细胞数量的多少可以通过其活性反映出来，也间接反映出c5a对pvec细胞的生物活性。
[0046]
将rhc5a的浓度确定在100μg/l，将单克隆抗体按10、50、100μg/ml的浓度,与rhc5a在37℃温育30min后,加入到pvec与pmn的培养体系中，单克隆抗体对mpo活性的影响见表2所示。以空白dmem培养基为对照。由表2 可见,随着单克隆抗体的浓度上升，mpo活性单位则下降，反映出单克隆抗体 3f11对c5a/c5ar互作的拮抗作用。
[0047]
表2单抗对rhc5a诱导的pvec-pmn mpo活性的影响(103u/well)
[0048]
组别mpo活性空白组0.091
±
0.003rhc5a1.567
±
0.11610μg/ml单抗0.601
±
0.01250μg/ml单抗0.388
±
0.015100μg/ml单抗0.209
±
0.005
[0049]
从表2的结果可以看出，本发明的单克隆抗体3f11能够以剂量依赖性方式抑制rhc5a的功能，能够拮抗rhc5a与c5ar的或作，进而降低pvec粘附 pmn细胞数量。
[0050]
实施例7单抗在急性心衰小鼠模型中的实验验证
[0051]
分组及急性心衰模型制作：12周龄小鼠，体质量25g左右，实验动物均给予普通饮食，自由饮水。选择12周龄野生型小鼠及c5ar敲除小鼠，分别随机分为野生小鼠对照组、野生小鼠心衰组、野生小鼠心衰单抗治疗组、c5ar 敲除小鼠组、c5ar敲除小鼠心衰组等共4组，每组5只。按照本领域常规的急性心衰小鼠模型制备方法采用单次腹腔注射阿霉素20mg/kg，建立小鼠急性心衰模型，对照组采用同计量0.9％氯化钠注射。经过检测，心衰组血压计体质量均显著降低，左心室射血分数及左心室短轴缩短率均显著降低，提示阿霉素心衰小鼠模型制备成功。将野生小鼠心衰单抗治疗组给予本发明制备的3f11单抗1mg/kg，每3d给药1次，共治疗2周。其余心衰组和对照组均采用生理盐水对照给药。检测各组心肌纤维沉积面积的情况，结果如图1所示。
[0052]
从图1可以看出，野生小鼠心衰单抗治疗组经过3f11单抗治疗后，纤维沉积面积相对于野生心衰组显著的降低，其与c5ar敲除小鼠心衰组相比沉积基本一致。而且，与野生小鼠心衰组相比，c5ar敲除小鼠心衰组和野生小鼠心衰单抗治疗组心肌细胞排列都相对整齐，稍有空泡形成。小鼠心衰单抗治疗组的间质纤维化沉积相对于小鼠心衰组相比降低了29.3％。这说明，在急性心衰模型中，c5ar被单抗抑制活性后，心肌破坏及纤维化程度减轻。
[0053]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。