一种利用芽孢杆菌Bacillus.spHZ3制备生物纳米硒化银的方法

一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米硒化银的方法
技术领域
1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米硒化银的方法。


背景技术：

2.作为一种新型的金属化合物纳米材料，纳米硒化银具有许多独特的性能，在光电电池、光学器件、离子选择电极，感光材料等众多领域得到了广泛应用。同时，随着医学技术的发展，越来越多的研究表明，近红外量子点作为一种新型的纳米荧光探针在生物检测方面具有十分明显的优势。近红外波段作为“第二生物窗口”(700-900nm)，具有的背景干扰小、穿透深度大等特点。这就使得近红外量子点因其能克服可见光量子点进行深层组织成像时易受干扰的缺陷等，在生物成像应用中更具优势。近红外量子点(cdse，cds，pbse，pbs等)被广泛用于生物大分子和细胞标记、组织和活体细胞成像、肿瘤模型定位、临床诊断等多个领域，并取得了突破性的进展。硒化银(ag2se)作为一种新型的近红外二元含银量子点，具有低毒性、尺寸小、近红外光学特性优异等特性，一方面，它弥补了含重金属元素(镉或铅)量子点对环境和生物体系毒性较大的问题，可以有效地降低量子点的生物毒性。另一方面，由于其本身为近红外波段量子点，可以很好的与生物组织本身的自发荧光相区分，提高细胞分辨能力，且具有较深的穿透深度，能有更好的进行生物应用，因此具有较好的生物领域应用前景。
3.常规合成纳米硒化银的方法包括水热/溶剂热法、高温溶液法、超声化学法等。这些方法通常需要高温或较复杂的设备。ag2se纳米颗粒的常温常压制备也可在乙二胺中实现，但用需要用到大量的有毒有机溶剂，容易造成环境污染。因此，新兴的、符合可持续发展的生物法逐渐成为制备纳米硒化银的研究热点生物法合成纳米硒化银，反应条件温和，成本低廉，对环境友好。同时，生物体中含有许多具有还原性和稳定性的活性成分，在还原ag
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合成纳米硒化银的同时，还能对制备的纳米硒化银粒子形成覆盖隔离的效果，以减少粒子间的团聚，使得合成的纳米硒化银比常规方法合成的纳米硒化银稳定性更强，因此成为目前纳米硒化银合成的研究热点。
4.生物法合成纳米硒化银主要通过细或者真菌等完成。其中，细菌因其繁殖迅速，便于通过遗传工程操作改造，在制备纳米硒化银方面有很大的优势。目前已报道菌株pantoea sp.imh可以合成硒化银纳米颗粒，但是该菌株对ag
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的抗性较弱，只能在ag
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浓度为1mmol/l，se浓度为1-10mmol/l的情况下合成硒化银纳米颗粒，且合成硒化银纳米颗粒的过程中也会伴随合成纳米银颗粒，这也在一定程度上限制了纳米硒化银的产量和应用。
5.公布号为cn111774037a的中国专利，公开了一种zif-67-硒化银纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：将硝酸钴溶于甲醇溶液中，超声分散均匀，得溶液a，将2-甲基咪唑溶于甲醇溶液中，超声分散均匀，得溶液b。将溶液b缓慢滴加入a中，静置、离心、甲醇洗涤得zif。称取适量zif-67于20ml水中分散得溶液a，称取适量硒粉溶于水合肼溶液中得溶液
b，将ab溶液装入三口瓶中，加入磁石，油浴，称取适量硝酸银溶于水中，加入三口瓶中，继续反应2h，将所得溶液离心、洗涤制得成品。所制得的纳米复合离子成立方体型，大小均一，分散性好，毒性小，且在近红外光的照射下，可表现出高效的光热转化性能，可应用于肿瘤的光热治疗等生物医用领域。该方法工艺简单，能耗低，设备数量少，但是该方法操作步骤多，且需要用到甲醇和水合肼等有毒化合物，因此存在潜在的健康风险和环境污染问题，有待进一步改进。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于如何利用传统物理、化学方法制备纳米硒化银容易对环境造成危害、操作复杂、生产成本高、效率低的问题。
7.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
8.菌株说明：本发明所使用的芽孢杆菌bacillus.sp hz3，保藏编号：cctcc no：m20221472，保藏日期：2022年9月21日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
9.本发明提供一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米硒化银的方法，包括以下步骤：
10.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至ynp培养基中培养，获得菌种培养液；
11.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液加入到发酵培养基中，培养至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到107cfu/ml；
12.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂，继续培养至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到108cfu/ml；
13.(4)添加硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)：向步骤(3)获得的培养液中，加入硝酸银溶液培养，再加入亚硒酸钠溶液培养；
14.(5)诱导合成生物纳米硒化银：硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)添加完成后，先采用常温培养，再转入低温培养，随后再次转入常温培养，培养至培养液颜色由浅黄色变为褐色，且颜色不再变深时，纳米硒化银完全生成；
15.(6)分离提取硒化银纳米颗粒：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心操作，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心操作，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米硒化银。
16.有益效果：本发明通过采用特殊的菌株芽孢杆菌bacillus.sp hz3，生物法合成纳米材料，反应条件温和，成本低廉，操作简便，提高了制备纳米硒化银的效率。
17.优选的，所述步骤(1)中的ynp培养基由蛋白胨5-10g，牛肉粉3-5g，酵母粉5-10g，维生素b
2 1-3mg，硝酸钠0.1-0.3g，纯水1000ml制成。
18.优选的，所述步骤(2)中，将步骤(1)获得的菌种培养液按照1-3％(v/v)加入到发酵培养基中。
19.优选的，所述步骤(2)中发酵培养基由蛋白胨5-10g，牛肉粉3-5g，酵母粉5-10g，氯化钠1-3g，硝酸钠0.1-0.5g，氯化钙0.01-0.04g，维生素b
2 1-3mg，纯水1000ml制成。
20.优选的，所述步骤(3)中诱导剂为苯丙氨酸，ctab，半胱氨酸中的一种或多种。
21.优选的，所述步骤(3)中诱导剂的浓度为1-15mg/l。
22.优选的，所述步骤(4)中硝酸银溶液的浓度为100mol/l，亚硒酸钠溶液的浓度为1mol/l，所述硝酸银溶液与培养液的体积比为(1-5)：50；所述亚硒酸钠溶液与培养液的体积比为(1-5)：1000。
23.优选的，所述步骤(5)中常温均指28-37℃，低温是指15-20℃。
24.优选的，所述步骤(5)中，先采用28-37℃、150-200rpm振荡培养8-14h，随后转入低温培养，15-20℃、150-200rpm继续振荡培养8-14h，随后再次转入28-37℃、150-200rpm振荡培养。
25.优选的，所述步骤(6)中初步离心的转速为6000-10000r/min，时间3-8min。
26.优选的，所述步骤(6)中二次离心的转速为20000-30000r/min，时间10-20min。
27.优选的，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)培养的条件均为28-37℃、150-200rpm振荡培养。
28.优选的，所述步骤(1)中培养的时间为12-14h；步骤(2)中培养的时间为6-8h；步骤(3)中培养的时间为4-6h。
29.实验结果：所得到的纳米硒化银颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为10-20nm。采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为10-20nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag和se的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米硒化银颗粒。
30.本发明的优点在于：
31.(1)本发明通过采用特殊的菌株芽孢杆菌bacillus.sp hz3，生物法合成纳米材料，反应条件温和，成本低廉，操作简便，提高了制备纳米硒化银的效率。
32.(2)本发明采用的纳米硒化银合成菌株芽孢杆菌bacillus.sphz3，对重金属(cu，pb，ag等)均具有非常强的耐受性和还原能力。该菌株可以耐受10mm的硝酸银和10mm的亚硒酸钠，且可以在生长的过程中，持续不断合成纳米硒化银，从而大大降低纳米硒化银的生产成本。
33.(3)本发明针对bacillus.sphz3合成纳米硒化银的特点，在合成过程中添加了专用诱导剂，并采用了高温培养-低温培养-高温培养相结合的方法，从而更进一步提高了纳米硒化银的合成效率，使得芽孢杆菌bacillus.sphz3在48h内即可将4mm硝酸银和2mm亚硒酸钠全部转化为纳米硒化银，大大提高了纳米硒化银的合成效率。
附图说明
34.图1为芽孢杆菌bacillus.sp hz3不同培养条件下合成的纳米硒化银颗粒的透射电镜观察图；
35.图2为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银颗粒的元素组成的eds分析图；
36.图3为不同培养阶段芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银的uv-vis特征光谱分析图；
37.图4为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银的xrd分析图；
38.图5为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银的xps分析图；
39.图6为添加诱导剂对芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银的影响图。
具体实施方式
40.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1：
42.一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米硒化银的方法，包括以下步骤：
43.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至ynp培养基中28℃、150rpm振荡培养14h，获得菌种培养液；ynp培养基由蛋白胨5g，牛肉粉3g，酵母粉5g，维生素b
2 1mg，硝酸钠0.1g，纯水1000ml制成；
44.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液按照1％(v/v)加入到发酵培养基中，28℃、150rpm振荡培养6h，至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到107cfu/ml；发酵培养基由蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉10g，氯化钠3g，硝酸钠0.5g，氯化钙0.04g，维生素b
2 3mg，纯水1000ml制成；
45.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂(苯丙氨酸)，使得诱导剂终浓度为1mg/l，继续28℃、150rpm振荡培养4h，至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到108cfu/ml；
46.(4)添加硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)：向步骤(3)获得的培养液中，加入2ml的100mol/l硝酸银溶液培养，再加入0.1ml的1mol/l亚硒酸钠溶液培养；
47.(5)诱导合成生物纳米硒化银：硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)添加完成后，先采用28℃、150rpm振荡培养14h，随后转入低温培养，15℃、150rpm继续振荡培养14h，随后再次转入28℃、150rpm振荡培养，培养至培养液颜色由浅黄色变为褐色，且颜色不再变深时，纳米硒化银完全生成；
48.(6)分离提取硒化银纳米颗粒：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心6000r/min，时间8min，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心20000r/min，时间20min，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米硒化银。
49.icp-aes测定结果表明，加入的agno3和na2seo3有65.4％被转化成硒化银ag2se。所得到的纳米硒化银颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为10-20nm。采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为10-20nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag和se的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米硒化银颗粒。
50.实施例2：
51.一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米硒化银的方法，包括以下步骤：
52.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至ynp培养基中32℃、180rpm振荡培养13h，获得菌种培养液；ynp培养基由蛋白胨8g，牛肉粉4g，酵母粉8g，维生素b
2 2mg，硝酸钠0.2g，纯水1000ml制成；
53.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液按照2％(v/v)加入到发酵培养基中，32℃、180rpm振荡培养7h，至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到107cfu/ml；发酵培养基由蛋白胨8g，牛肉粉4g，酵母粉8g，氯化钠2g，硝酸钠0.3g，氯化钙0.03g，维生素b
2 2mg，
纯水1000ml制成；
54.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂(苯丙氨酸，ctab和半胱氨酸，质量比2:1:2)，使得诱导剂终浓度为10mg/l，继续32℃、180rpm振荡培养5h，至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到108cfu/ml；
55.(4)添加硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)：向步骤(3)获得的培养液中，加入5ml的100mol/l硝酸银溶液培养，再加入0.3ml的1mol/l亚硒酸钠溶液培养；
56.(5)诱导合成生物纳米硒化银：硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)添加完成后，先采用32℃、180rpm振荡培养12h，随后转入低温培养，18℃、180rpm继续振荡培养12h，随后再次转入32℃、180rpm振荡培养，培养至培养液颜色由浅黄色变为褐色，且颜色不再变深时，纳米硒化银完全生成；
57.(6)分离提取硒化银纳米颗粒：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心8000r/min，时间5min，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心25000r/min，时间15min，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米硒化银。
58.icp-aes测定结果表明，加入的agno3和na2seo3完全(100％)被转化成硒化银ag2se。所得到的纳米硒化银颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为10-20nm。采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为10-15nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag和se的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米硒化银颗粒。
59.实施例3：
60.一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米硒化银的方法，包括以下步骤：
61.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至ynp培养基中37℃、200rpm振荡培养12h，获得菌种培养液；ynp培养基由蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉10g，维生素b
2 3mg，硝酸钠0.3g，纯水1000ml制成；
62.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液按照3％(v/v)加入到发酵培养基中，37℃、200rpm振荡培养6h，至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到107cfu/ml；发酵培养基由蛋白胨5g，牛肉粉3g，酵母粉5g，氯化钠1g，硝酸钠0.1g，氯化钙0.01g，维生素b
2 1mg，纯水1000ml制成；
63.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂(苯丙氨酸和ctab，质量比1:2)，使得诱导剂终浓度为15mg/l，继续37℃、200rpm振荡培养4h，至培养液中bacillus.sp hz3菌群数量达到108cfu/ml；
64.(4)添加硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)：向步骤(3)获得的培养液中，加入10ml的100mol/l硝酸银溶液培养，再加入0.5ml的1mol/l亚硒酸钠溶液培养；
65.(5)诱导合成生物纳米硒化银：硝酸银(agno3)和亚硒酸钠(na2seo3)添加完成后，先采用37℃、200rpm振荡培养8h，随后转入低温培养，20℃、200rpm继续振荡培养8h，随后再次转入37℃、200rpm振荡培养，培养至培养液颜色由浅黄色变为褐色，且颜色不再变深时，纳米硒化银完全生成；
66.(6)分离提取硒化银纳米颗粒：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心10000r/min，时间3min，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心30000r/min，时间10min，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米硒化
银。
67.icp-aes测定结果表明，加入的agno3和na2seo3有36.2％被转化成硒化银ag2se。所得到的纳米硒化银颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为10-20nm。采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为10-15nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag和se的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米硒化银颗粒。
68.图1为芽孢杆菌bacillus.sp hz3不同培养条件下合成的纳米硒化银颗粒的透射电镜观察图；(a：实施例1制备的硒化银；b：实施例2制备的硒化银；c：实施例3制备的硒化银)；
69.图2为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银颗粒的元素组成的eds分析图；合成的纳米颗粒明显具有ag和se的特征峰；
70.图3为不同培养阶段芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银的uv-vis特征光谱分析图；合成的纳米硒化银均在420nm处有特征峰；
71.图4为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sp hz3合成的纳米硒化银的xrd分析图。合成的纳米硒化银的xrd图谱显示出明显的特征峰，与标准ag2se(jcpds no.24
–
1041)的峰图相吻合；
72.图5为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米硒化银的xps分析图；
73.图6为添加诱导剂对芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米硒化银的影响(a：不添加诱导剂，b：单独添加苯丙氨酸，c：添加苯丙氨酸和ctab)，从图中可以看出，不同的添加剂对合成纳米硒化银的效率不同。
74.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。