一株有效合成脂多糖的基因工程菌

本发明涉及一株有效合成脂多糖的基因工程菌，具体涉及一种无抗性的脂多糖大肠杆菌生产菌，属于遗传工程和生物合成。

背景技术：

0、技术背景

1、脂多糖是体现革兰氏阴性菌毒力的活性成分，其可以被宿主免疫细胞表面的tlr4/md2所识别，是感染宿主的毒力因子。接受胞外信号后，tlr4刺激诱导细胞内蛋白复合物的形成，从而激活细胞内信号级联反应。这些反应触发多种刺激性细胞因子如白细胞介素1、8、12、α型肿瘤坏死因子(il-1、il-8、il-12、tnfα)的生物合成和分泌，并产生最终激活体液和细胞反应的共刺激分子。脂多糖结构中起免疫作用的活性结构为类脂a，类脂a含有六酰化酰基链，两个磷酸残基，每个酰基链含有12-14个碳，是人类tlr4的最有效刺激物，可以最大程度地激发免疫反应。当接种天然含有lps等细菌成分的疫苗或其衍生物的疫苗后，都能够增强疫苗的免疫强度。这种为抗原提供“帮助”的分子被定义为佐剂。添加了合适佐剂的疫苗引起的免疫反应加强，免疫范围扩大。

2、随着人们对其致病机制的深入研究，脂多糖(lipopolysaccharide，lps)广泛用于动物免疫实验。但是天然合成脂多糖的大肠杆菌菌株产量较低。因此，有必要通过基因工程构建一株可以有效合成脂多糖的大肠杆菌来解决上述问题。同时，获得不带抗性标记和/或不影响菌体生长的基因工程菌是非常有必要的。

技术实现思路

1、为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种无任何抗性标记，生长状况良好的产lps的新型基因工程菌，以适应大规模生产。本发明的大肠杆菌基因工程菌，缺失了npr、yhbj和fabf中的至少一个基因，同时不带任何抗性标记、遗传背景很清晰、生长状况较好；其中三基因缺失的e.coliw3110△npr△yhbj△fabf(命名为菌株wozf)，生产脂多糖的产量可达9.56mg·g-1dcw，比野生型大肠杆菌w3110的脂多糖产量提高了40.6％。

2、本发明的第一个目的是提供一种有效合成脂多糖的基因工程菌，所述基因工程菌的npr、yhbj、fabf中的至少一个基因发生了缺失突变。

3、在一种实施方式中，所述基因工程菌是在大肠杆菌w3110的基础上发生缺失突变的。

4、在一种实施方式中，所述npr、yhbj、fabf基因敲除片段的氨基酸序列，分别如ncbi上"bae77250.1"、"bae77249.1"、"baa35903.1"所示。对npr、yhbj、fabf基因进行单敲除后得到的基因工程菌，其脂多糖产量比大肠杆菌w3110的脂多糖产量分别提高了18.6％、29.6％、29.0％。

5、在一种实施方式中，所述基因工程菌是在大肠杆菌w3110的基础上发生了npr、yhbj、fabf基因的三重缺失突变，获得的基因工程菌e.coliw3110△npr△yhbj△fabf，其脂多糖产量比大肠杆菌w3110的脂多糖产量提高了40.6％，达到了9.56mg·g-1dcw。

6、在一种实施方式中，所述缺失突变是采用crispr-cas9敲除系统，在大肠杆菌w3110中进行基因敲除。

7、在一种实施方式中，所述敲除，是使用crispr-cas9敲除系统的cas酶介导的片段重组，最终42oc培养去除pcas质粒，获得无抗性有效合成脂多糖的基因工程菌。

8、本发明的第二个目的是提供利用本发明的基因工程菌生产脂多糖的方法。

9、在一种实施方式中，所述方法是对基因工程菌进行发酵培养；培养后提取脂多糖；其中脂多糖的提取是采用热酚水解法提取大肠杆菌的lps。

10、所述脂多糖的提取具体是：将发酵培养的基因工程菌菌液离心、去上清，加入ddh2o，然后加入体积分数90％的热苯酚，旋紧盖子后，放在水浴摇床中震荡确保菌体充分裂解；冷却、离心、静置，然后转移上相至透析袋中，放入去离子水中透析；透析完成后，收集透析袋中液体进行冷冻干燥得到洁白蓬松团状粗样lps；然后进行粗样纯化。

11、所述粗样纯化具体是：将粗样lps重悬到tris-hcl缓冲液中，加入dnase i、rnasea以去除核酸污染，然后水浴反应一段时间；再加入蛋白酶k去除残余的蛋白质；然后加入水饱和酚终止反应，沉淀所有蛋白，混合呈浊液，离心3取上相，透析，冷冻干燥后复溶于氯仿甲醇混合液中，离心取上清，洗涤，再次冻干、复溶于水，冻干，得到lps纯品。

12、在一种实施方式中，脂多糖的提取，具体是：

13、采用热酚水解法提取大肠杆菌的lps，种子过夜培养后，以初始od600＝0.02转接到200ml lb培养基中，37℃，200rpm培养16h，测定菌体浓度，记录。以经验值od600＝0.323gdcw·l-1为标准，规定干物质的量258.4g，计算得到菌液体积(记为v1)。将不同体积、相同干重的菌液转移到大离心瓶，以8000g转速，离心20min，弃上清。用ddh2o 15ml吹吸沉淀，全部转移至干净的50ml离心管中。加入15ml体积分数90％的热苯酚，旋紧盖子后，放在68℃水浴摇床中震荡，转速150rpm振荡时长1h，期间每20分钟上下颠倒离心管一次，确保菌体充分裂解。水浴振荡结束后通风冷却至室温，转速4000g，温度4℃，离心20min分相，继续静置4-8小时。小心转移上相5ml(记为v2)至透析袋中，放入去离子水中透析24h，每隔4h换水一次。透析完成后，将透析袋中液体完全倒进另一干净50ml离心管中，-80℃冷冻2-3h，冷冻至不透明后放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥2天，得到洁白蓬松团状粗样lps。粗样纯化：将含有杂质的lps粗样，重悬到10ml tris-hcl缓冲液中(配方为100mm ph 7.5tris-hcl，25mm mgcl2，1mm cacl2)。加入dnase i，rnasea以去除核酸污染，两者的使用工作浓度均为1μg·mg-1，在37℃水浴摇床下反应2小时。再加入1μg·mg-1蛋白酶k去除残余的蛋白质，同样放置于37℃水浴摇床中反应2小时。此时加入5ml水饱和酚终止反应，沉淀所有蛋白(水饱和酚需要提前一天进行制作，向300g苯酚中加入80ml去离子水，水浴加热搅拌至溶解，随后转移至装有200ml去离子水的1l分液漏斗中，轻轻震荡混合，呈乳浊液。静置6小时分层，下层无色透明液体即为水饱和酚。分液漏斗放出下层到棕色试剂瓶里保存。)。混匀呈浊液，4000rpm离心30分钟，取上相，透析24小时。随后重复冻干操作，得到的蓬松固体复溶于氯仿：甲醇＝2：1混合液中，12000rpm离心20分钟，倒掉上清后重复洗涤一遍。再次冻干，复溶于水中，再次冻干，得到lps纯品。

14、在一种实施方式中，所述发酵培养为常规发酵方法进行培养。

15、本发明的第三个目的是通过所述基因工程菌的应用。

16、在一种实施方式中，所述应用，是利用基因工程菌生产脂多糖，然后将脂多糖用于细胞免疫或者制备含有脂多糖成分的疫苗。

17、在一种实施方式中，所述含有脂多糖成分的疫苗，包括但不限于减毒疫苗、灭活疫苗。

18、本发明的有益效果：

19、本发明中，单敲除npr编码基因npr，解决了npr对lpxd酶活性的抑制；敲除yhbj，部分解除胞内udp-glcnac的负反馈抑制，增加了lps合成第一步的底物；敲除fabf基因，降低了饱和脂肪酸对lpxk的活性抑制；联合敲除上述三个基因，构建得到了菌株wozf。

20、本发明的基因工程菌wozf，其中基因npr、yhbj和fabf发生缺失突变失活。本发明构建的菌株脂多糖合成量较野生型e.coli w3110增加40.6％，生长状况良好，没有引入任何外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。