一种创制硃砂烟的引物、重组表达载体、转化体、试剂盒及方法与应用与流程

本发明属于遗传工程，具体涉及一种创制硃砂烟的引物、重组表达载体、转化体、试剂盒及方法与应用。

背景技术：

1、硃砂烟的烤后烟叶外观呈红色，具有独特的糯米香韵，是一种受到工业企业广泛关注的特色烟草原料。硃砂烟是烤烟品种(nicotiana tobacum)的自发突变株，由于突变概率极低造成硃砂烟叶产量极低，导致硃砂烟叶非常稀缺、供不应求。为了保障硃砂烟原料规模化、稳定供应，人工创制硃砂烟具有重要意义。

2、本领域现有技术目前尚未出现有关人工创制硃砂烟植株的报道，本领域也亟需开发一种可人工创制硃砂烟的产品和方法。

技术实现思路

1、基于本领域现有技术存在的上述空白和需求，本发明提供一种创制硃砂烟的引物、重组表达载体、转化体、试剂盒及方法与应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种创制硃砂烟的引物，其特征在于，其上下游引物的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

4、一种创制硃砂烟的重组表达载体，其特征在于，为表达载体上连接有采用上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示的引物以烟草cdna为模板进行pcr得到的产物。

5、所述表达载体选自：由topo载体、pentrtm2b载体、pk2gw7载体组成的组。

6、一种创制硃砂烟的转化体，其特征在于，为宿主细胞中转化有一种创制硃砂烟的重组表达载体；所述一种创制硃砂烟的重组表达载体为表达载体上连接有采用上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示的引物以烟草cdna为模板进行pcr得到的产物。

7、所述表达载体选自：由topo载体、pentrtm2b载体、pk2gw7载体组成的组；

8、优选地，所述宿主细胞选自：大肠杆菌dh5α感受态细胞、和/或农杆菌感受态细胞。

9、一种创制硃砂烟的试剂盒，包括：所述的一种创制硃砂烟的引物。

10、所述的一种创制硃砂烟的试剂盒，还包括：所述的一种创制硃砂烟的重组表达载体、和/或，所述的一种创制硃砂烟的转化体。

11、一种创制硃砂烟的方法，其特征在于，在烟草植株中过表达：采用上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示的引物以烟草cdna为模板进行rt-pcr得到的产物。

12、所述过表达指：将所述产物连接至表达载体得到重组表达载体；

13、优选地，将重组表达载体转化至宿主细胞得到转化体；

14、优选地，将转化体转化至烟草植株中；

15、优选地，所述表达载体选自：由topo载体、pentrtm2b载体、pk2gw7载体组成的组；

16、优选地，所述宿主细胞选自：大肠杆菌dh5α感受态细胞、和/或农杆菌感受态细胞；

17、优选地，所述rt-pcr包括pcr反应；每微升pcr反应体系包括：0.2μl反应缓冲液、10mmdntp、10μm上下游引物、0.04udna聚合酶、4ngcdna模板；

18、优选地，所述反应缓冲液为5×phusionhf反应缓冲液；

19、优选地，所述pcr反应程序包括：98℃，30秒；以98℃，7秒；62℃，30秒；72℃，45秒为1个循环，共35个循环；72℃延伸7分钟；

20、优选地，所述烟草植株指烤烟品种的烟草植株。

21、所述的一种创制硃砂烟的方法、和/或，所述的一种创制硃砂烟的方法创制的硃砂烟在烟草育种、和/或烟草制品加工方面的应用。

22、本发明公开了一种创制硃砂烟的引物，其上下游引物序列分别如seq idno.1和seq id no.2所示。本发明通过实验证实，在烟草植株内过表达该引物扩增的产物可使普通烟草转换成硃砂烟，即，转基因烟草植株的烟叶烤后呈现红色外观，具有硃砂烟的表型。基于所述引物，本发明进一步提供该引物的扩增产物连接表达载体所得到的重组表达载体、及其转化体和相关试剂盒，同时提供一种基于该引物的创制硃砂烟的方法。该方法的特点就是在烟草植株中过表达所述引物扩增的产物获得转基因烟草。所述过表达部位为任意部位的烟草组织，包括但不限于烟草的根部、茎或叶片任一组织或多种的组合。经转基因烟草鉴定，如图3所示，所述扩增产物在转基因烟草植株中的表达水平显著高于非转基因烟草植株。通过所述方法获得的转基因烟草，与同等生长条件、遗传背景条件下的烟草植株相比，前者烤后烟叶外观呈红色，感官评价具有明显的糯米香，成功解决了人工创制硃砂烟的难题，填补了人工创制硃砂烟的空白。

技术特征：

1.一种创制硃砂烟的引物，其特征在于，其上下游引物的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

2.一种创制硃砂烟的重组表达载体，其特征在于，为表达载体上连接有采用上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示的引物以烟草cdna为模板进行pcr得到的产物。

3.根据权利要求2所述的一种创制硃砂烟的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体选自：由topo载体、pentrtm2b载体、pk2gw7载体组成的组。

4.一种创制硃砂烟的转化体，其特征在于，为宿主细胞中转化有一种创制硃砂烟的重组表达载体；所述一种创制硃砂烟的重组表达载体为表达载体上连接有采用上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示的引物以烟草cdna为模板进行pcr得到的产物。

5.根据权利要求4所述的一种创制硃砂烟的转化体，其特征在于，所述表达载体选自：由topo载体、pentrtm2b载体、pk2gw7载体组成的组；

6.一种创制硃砂烟的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的一种创制硃砂烟的引物。

7.根据权利要求6所述的一种创制硃砂烟的试剂盒，其特征在于，还包括：权利要求2或3所述的一种创制硃砂烟的重组表达载体、和/或，权利要求4或5所述的一种创制硃砂烟的转化体。

8.一种创制硃砂烟的方法，其特征在于，在烟草植株中过表达：采用上下游序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示的引物以烟草cdna为模板进行rt-pcr得到的产物。

9.根据权利要求8所述的一种创制硃砂烟的方法，其特征在于，所述过表达指：将所述产物连接至表达载体得到重组表达载体；

10.权利要求8或9所述的一种创制硃砂烟的方法、和/或，权利要求8或9所述的一种创制硃砂烟的方法创制的硃砂烟在烟草育种、和/或烟草制品加工方面的应用。

技术总结
本发明一种创制硃砂烟的引物、重组表达载体、转化体、试剂盒及方法与应用，属于遗传工程技术领域。所述一种创制硃砂烟的引物的上下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。基于所述引物，本发明还提供一种创制硃砂烟的重组表达载体、转化体、试剂盒及方法，以及该方法的应用。本发明通过在烟草植株内过表达所述引物扩增的产物可使普通烟草转换成硃砂烟，即，转基因烟草植株的烟叶烤后呈现红色外观，感官评价具有明显的糯米香，转基因烟草植株具有硃砂烟的表型。本发明成功解决了人工创制硃砂烟的难题，填补了人工创制硃砂烟的空白。

技术研发人员：宋中邦,隋学艺,张谊寒,刘加红,单双吕,陈小龙,黄坤,王亚辉,马宇平,蒲洪源
受保护的技术使用者：云南省烟草农业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13