蒙古羊基因B4GALNT2的分子标记的特异性引物及其应用

本发明属于分子生物学领域，具体涉及蒙古羊基因b4galnt2的分子标记的特异性引物及其应用。

背景技术：

1、b4galnt2（beta-1,4-n-acetyl-galactosaminyl transferase 2）即β-1,4-n-乙酰氨基半乳糖转移酶2，属于n-乙酰氨基半乳糖转移酶（galnac –tases）家族，该家族是一类重要的催化o-糖基化的初始酶，主要负责将n-乙酰半乳糖胺（galnac）从udp-galnac供体转移到受体蛋白多肽链特定序列中的丝氨酸或苏氨酸羟基上从而合成o-聚糖。羊的b4galnt2基因位于11号染色体上，全长62654 bp，包含11个外显子，10个内含子。

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5、在鉴定影响（lacaune）绵羊排卵率主效基因fecl的基因座研究中，发现b4galnt2基因是fecl的基因座仅包含的两个基因之一。在研究b4galnt2的异位表达与lacaune绵羊的高产表型的相关性中，发现b4galnt2基因在携带fecl纯合突变的母羊卵巢中表达量比野生型个体高1000倍，同时发现b4galnt2基因的过表达会导致fecl纯合突变母羊卵巢中10种以上的糖蛋白发生非典型糖基化，而这种糖基化已被证明会使得小鼠的生育能力增强，并鉴定出该基因7号内含子上存在的g.36938224a/t（genbank accession:nc_040262.1）snp与fecl基因存在完全连锁不平衡，因此b4galnt2是fecl的最佳定位和表达候选基因。而fecl基因是影响lacaune绵羊排卵率的主效基因，因此可以认为b4galnt2基因是影响绵羊排卵率和多胎率的候选功能基因。

6、单核苷酸多态性标记（singlenucleotide polymorphism, snp）是指单个核苷酸发生改变而引起的dna序列多态性，具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将这些遗传标记与生长性状相关联，从而实现在dna水平上进行选择育种，有效的避免人为影响并提高选择育种的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，缩短育种周期，大大加快选育进程。利用kapa血液pcr方法通过对高多胎性状绵羊品种d' man羊群体b4galnt2基因的g.36938224a/t snp位点进行基因分型检测，发现该位点与d' man羊多胎率显著相关，并且b4galnt2基因的g.36938224a/t snp位点也与noire du velay羊的多胎性状显著相关利用。

7、sanger测序的方法发现在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、滩羊、白萨福克羊、黑萨福克羊、东佛里生羊、陶赛特羊、肉用美利奴羊、杜泊羊、柯利黛绵羊共11种绵羊样本中均未检测到b4galnt2基因的g.36938224a/t snp位点突变。但他们发现，位于b4galnt2基因5号外显子g.36946470c/t snp位点和8号外显子g.36933082c/t snp位点与小尾寒羊的第一次多胎性状显著相关（p＜0.05）。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种蒙古羊基因b4galnt2的分子标记的特异性引物。

2、本发明的再一目的在于提供上述特异性引物的应用。

3、本发明采用dna测序技术检测待测蒙古羊基因组中的b4galnt2基因7号内含子区是否存在g.25929793g/t突变位点，确定了b4galnt2基因中的g.25929793g/tsnp位点对我国蒙古羊多胎性状的遗传效应，从而，借助判断蒙古羊个体在上述位点的基因型，筛选育种用蒙古羊。

4、根据本发明的具体实施方式的蒙古羊基因b4galnt2的分子标记的特异性引物，所述引物序列如下：

5、seq id no.1：5′-gggtcttttgtgttataaaact-3′;

6、seq id no.2：5′-aaactacctaagaccaaatcc-3′。

7、本发明的蒙古羊繁殖力相关基因b4galnt2的分子标记的特异性引物可应用于检测蒙古羊多胎性状的试剂盒，或者应用于辅助蒙古羊育种中。

8、根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊繁殖力的方法，所述方法包括利用上述的特异性引物扩增蒙古羊基因组dna的步骤。

9、具体的，根据本发明具体实施方式的提高蒙古羊繁殖力的方法，所述方法

10、包括以下步骤：

11、（1）提取待测蒙古羊的基因组dna；

12、（2）以步骤（1）提取的蒙古羊的基因组dna为模板，用特异性引物进行pcr扩增，获得扩增产物；

13、（3）判断扩增产物中蒙古羊基因组中的b4galnt2基因7号内含子区是否存在g.25929793g/t突变位点，以确定蒙古羊个体在上述位点的基因型，然后通过基因型筛选种用蒙古羊。所述的b4galnt2基因的核苷酸序列ncbi reference sequence为nc_040262.1的羊11号染色体，第25929578到25930324位核苷酸。

14、所述蒙古羊基因组中的b4galnt2基因的g.25929793g/t snp的检测方法为：

15、利用pcr方法扩增蒙古羊b4galnt2基因genbank accession number为nc_040262.1的25929578到25930324位核苷酸的片段，并将扩增产物进行dna测序；

16、若在11号染色体第25929793个碱基的位置出现单峰且基因型为g，那么此基因型为gg；（图2）

17、如果在11号染色体第25929793个碱基的位置出现套峰，那么此基因型为gt；（图2）

18、通过基因型提高蒙古羊多胎性状为：所述g.25929793g/t 的gt基因型蒙古羊的平均多胎性状高于gg基因型，结果表明上述位点可以作用为蒙古羊多胎性状分子标记。

19、一种检测本发明所述的分子标记的方法，包括利用所述的引物对pcr扩增蒙古羊基因组中所述的分子标记，对扩增产物测序，判断蒙古b4galnt2基因g.25929793g/t位点的多态性。

20、本发明中，蒙古羊的繁殖力具体体现为每胎生产的羊羔数。

21、根据本发明具体实施方式的高蒙古羊繁殖力的方法，步骤（2）pcr扩增时，反应体系为25 μl，其中10 pmol/μl上下游引物各1.25 μl，2×taq master mix 12.5 μl，基因组dna（50~100 ng/μl）2 μl，ddh2o 8 μl。

22、根据本发明具体实施方式的高蒙古羊繁殖力的方法，步骤（2）pcr扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存，然后进行测序。

23、本发明的有益效果：

24、本发明发现b4galnt2基因的核苷酸序列ncbi reference sequence为nc_040262.1的羊11号染色体，25929578到25930324位核苷酸的片段区域存在蒙古羊多胎性状相关的分子标记。

25、本发明设计特异性引物，采用dna测序技术检测蒙古羊基因组中的b4galnt2基因中的g.25929793g/t snp位点对我国蒙古羊多胎性状的遗传效应。检测待测蒙古羊基因组中的b4galnt2基因7号内含子区是否存在g.25929793g/t突变位点，以确定蒙古羊个体在上述位点的基因型，然后通过基因型筛选种用蒙古羊。

26、数据统计结果表明，本发明的特异性引物能够检测该分子标记，从而可以用于辅助蒙古羊育种，提高蒙古羊的产羔数，本发明的方法可作为辅助提高蒙古羊多胎性状的有效方法。