一种高温Argonaute蛋白质及其应用

一种高温argonaute蛋白质及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种高温argonaute蛋白质及其应用。


背景技术：

2.argonaute(ago)蛋白是一类可编程的核酸酶，在进化上高度保守，广泛存在于真核生物和原核生物中。真核生物argonautes(eagos)是转录后基因调控和抗病毒防御过程中rna沉默途径的主要组成部分，它通过结合小的非编码rna(ncrna)作为引导，裂解互补的rna目标。目前，ago蛋白在许多细菌和古生物中也得到了表征。尽管最近的结构和生化研究表明，原核生物agos(pagos)在体外具有内切酶的功能，并在体内保护细胞免受外来遗传因子的影响，但其生物学作用仍然不清楚，有待进一步研究。系统发育分析将pagos分为几个支系，包括长pagos(进一步细分为两个亚支系，长a和长b)、短pagos和含有保守r和e残基的piwire piwi结构域蛋白。大多数长pagos含有与eagos相同的结构域，包括n端(n)、piwi-argonaute-zwille(paz)、中间(mid)、催化rnase h-like p element-induced wimpy testis(piwi)结构域。pagos与eagos有高度的结构同源性，迄今为止，大多数被表征的pagos属于长pago支系。eagos和具有催化活性的pagos都具有类似的催化过程，包括引导物结合、目标识别和催化。ago的内切酶活性存在于piwi结构域，它有一个催化性的dedx结构域(x是d、h、n或k)，从向导的5'端开始，在第10和11核苷酸之间的部位裂解互补的核酸。
3.迄今为止，少数pagos已被很好地表征出来，可以作为可编程的内切酶，利用dna或rna引导，以单链dna或rna为目标。早期对pagos的研究都来自于嗜热生物，并且都偏向于靶向裂解dna，如aaago(aquifex aeolicus)，ttago(thermus thermophilus)，pfago(pyrococcus furiosus)，mpago(marinitoga piezophila)和mjago(methanocaldococcus jannaschii)。由于其可编程性和识别的精确性，一些pagos已被应用于原核生物基因组编辑、核酸检测等。尽管pagos展现了丰富多彩的活性特征，但到目前为止大多数已经表征的pagos都更偏爱利用gdna切割靶ssdna或rna。尽管eagos被认为自pagos进化而来，但是目前大部分已经表征的pagos并不能像eagos一样在grna引导下去切割靶rna，pagos在体内的生理功能也尚不如eagos清楚。
4.为了更好地丰富体外基因编辑的工具，进一步了解pagos体内生理功能和进一步探索argonaute蛋白的进化过程至关重要；并且随着越来越多病毒引起的疾病的发生，多功能pagos的挖掘能够丰富现有的核酸检测方法，进一步运用到分子检测于诊断中。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明旨在提供一种新的高温argonaute蛋白质，通过对其结构和生化研究表明，该argonaute蛋白质能够利用5’p-gdna、5’oh-gdna去切割靶ssdna，有望用于体外的靶向dna编辑。
6.本发明的技术方案具体如下：
7.本发明第一方面提供了一种来源于高温原核生物thermococcus thioreducens的
argonaute蛋白质，并将其命名为ttdago，且其氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明第二方面提供了编码上述ttdago的基因，且该基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明第三方面提供了包含如seq id no.2所示基因序列的载体、细胞，该载体或细胞用于制备表达ttdago蛋白。
10.本发明第四方面提供上述ttdago蛋白质的制备方法，具体为：将seq id no.2所示基因序列与标签序列一起克隆至表达载体上，再转化至大肠杆菌中，采用iptg诱导表达；收集菌体后破菌取上清液，装入ni-nta琼脂糖树脂柱洗脱，纯化。
11.本发明第五方面提供了上述argonaute蛋白在特异性切割靶dna中的应用，其中靶dna为单链dna或双链dna。
12.进一步地，在上述应用方案中，argonaute蛋白特异性切割靶dna的方法具体为：上述argonaute蛋白先与单链向导dna结合成pago复合物，再将pago复合物与靶dna置于同一反应体系中，pago复合物切割靶dna，其中靶dna具有与单链向导dna序列互补配对的核苷酸序列。
13.进一步地，在上述应用方案中，单链向导dna的长度为13～30个核苷酸，单链向导dna的5’末端为羟基化或磷酸化。
14.进一步地，在上述应用方案中，靶ssdna与单链向导dna序列互补配对具体为：
15.(a)靶dna具有与单链向导dna序列完全互补的核苷酸序列；
16.或(b)靶dna具有与单链向导dna序列存在单个碱基错配的核苷酸序列。
17.更进一步地，单个碱基错配的错配位点可能在5’末端(位点1)，种子区(位点2～8)，中心区(位点9～12)，3’补充区(位点13～15)或3’尾巴区(位点16～18)。
18.进一步地，在上述应用方案中，pago复合物切割靶ssdna时的温度为45～95℃，优选为70～80℃，75℃为最佳。
19.进一步地，在上述应用方案中，反应体系中含有mn
2+
和/或mg
2+
，其中mn
2+
更优；更进一步地，在反应体系中，mn
2+
的浓度为0.02～10mm，mg
2+
的浓度为2.5～10mm。
20.进一步地，在上述应用方案中，反应体系除了含有二价阳离子如mn
2+
和/或mg
2+
外还含有缓冲溶液、无机盐和甘油；最佳地，反应体系含有10mm hepes-naoh ph 7.5，100mm nacl，5％甘油和二价阳离子。
21.本发明第六方面提供了一种核酸切割体系，该体系中包含：
22.(a)单链向导dna；
23.(b)如权利要求1所述的高温argonaute蛋白；
24.(c)任选的报告核酸，若所述报告核酸被剪切，所述剪切可被检测出。
25.本发明第七方面提供了上述ttdago蛋白，或核酸切割体系在制备靶标分子检测试剂盒中的应用。
26.本发明第八方面提供了一种pago蛋白，该蛋白通过对ttdago蛋白的核酸酶活性位点突变得到，且其已丧失切割活性。进一步地，ttdago蛋白的核酸酶活性位点包括seq id no.1所示序列的第534-542位、第572-581位、第604-612位和第721-729位。
27.本发明第九方面提供了一种位点特异性靶向阻断靶dna的体外方法，具体为：使用上述丧失切割活性的pago蛋白与向导dna结合形成pago-向导复合物，再使所得的pago-向
导复合物与靶dna接触，其中靶dna具有与向导dna序列大部分互补的核苷酸序列，该pago-向导复合物结合在靶dna上与向导大部分互补的区域。
28.本发明的有益效果为：
29.本发明提供了一种来源于高温原核生物thermococcus thioreducens的argonaute蛋白，该蛋白对单链向导dna(5’p-gdna，5’oh-gdna)具有结合活性，并对与单链向导dna互补配对的靶dna具有核酸酶活性，特别是5’p-gdna介导的靶dna切割活性皆高，故可利用ttdago进行体外的靶向dna编辑。
30.本发明提供的argonaute蛋白能够使用长度为13-30nt的5’p-gdna以及5’oh-gdna向导特异性切割靶dna，这使得核酸向导的合成更加简易。此外，该argonaute蛋白与单链向导dna结合得到的pago复合物不用依赖靶位点附近的特殊基序来识别和结合靶，核酸向导设计方便，不用考虑位点限制；而且pago复合物切割活性强，严格依赖于向导和靶的互补配对发挥切割活性，不存在crispr相关蛋白的非特异性“附带切割”活性，特异性更好。
附图说明
31.图1为本发明实施例1中sds-page凝胶分析ttdago纯度示意图；
32.图2为本发明实施例1中ttdago与部分已表征的argonaute蛋白的进化树；
33.图3为本发明实施例1中ttdago与已表征ago蛋白的序列比对示意图；
34.图4为本发明实施例2中用于测试的靶ssdna、靶ssrna、向导rna的序列示意图；
35.图5为本发明实施例2中ttdago切割靶ssdna和靶ssrna的检测结果图；
36.图6为本发明实施例3中不同核酸向导长度对靶ssdna切割活性影响的产物尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；
37.图7为本发明实施例4中不同金属阳离子对ttdago切割活性影响的产物尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；
38.图8为本发明实施例4中不同mn
2+
或mg
2+
离子浓度条件下对ttdago切割活性影响的产物尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；
39.图9为本发明实施例5中不同温度条件下对ttdago切割活性影响的产物尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；
40.图10为本发明实施例6中不同单碱基错配条件下对ttdago切割活性影响的产物尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；
41.图11为本发明实施例7中ttdago双突变体dm对靶ssdna切割活性影响的产物尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；
42.图12为本发明实施例8中用于测试的靶dsdna以及向导dna的序列示意图；
43.图13为本发明实施例8中ttdago切割靶dsdna琼脂糖凝胶检测结果图。
具体实施方式
44.为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
45.下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均
可从商业途径获得。
46.实施例1ttdago的表达和纯化
47.ttdago基因的核苷酸序列经过密码子优化后(优化后的序列如seq id no.2所示)交由生工生物工程股份有限公司进行合成，与c端6
×
his标签一起克隆到pet23a表达载体上，得到pet23a-ttdago，再转化至在大肠杆菌rosetta(de3)中，挑取单菌落接种至培养物含有50μg/ml的氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃、220rpm的摇床上摇瓶培养。当菌体达到od
600
达到0.8时，添加最终浓度为0.5mm的异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，并转移至18℃摇床过夜培养。6000rpm离心10min收集菌体，用buffer a(20mm tris-hcl ph 7.5，500mm nacl，10mm咪唑)充分洗涤后，将菌体重悬于buffer a，添加终浓度1mm的pmsf，并通过超声处理(scientz-iid：350w，2s on/4s off，30min)进行破菌。裂解液经14000rpm离心20分钟后收集上清液，并用0.45μm滤器进行过滤。
48.装入ni-nta琼脂糖树脂，将上清液加入后在4℃下旋转1-2小时，随后分别用含有20mm和50mm咪唑的buffer a各洗10个柱体积(分3次加入)，含有100mm、200mm、300mm、400mm、500mm、600mm、700mm、800mm咪唑各洗3个柱体积，并留样进行sds-page检测。将含有目的蛋白的洗脱液通过50k超滤管进行超滤，并用buffer b(20mm hepes ph7.5，500mm nacl，1mm二硫苏糖醇)进行换液和浓缩。用20mm hepes ph 7.5将nacl浓度稀释至125mm后，进行肝素柱(ge healthcare,boston,usa)纯化，肝素柱用buffer c(20mm hepes ph 7.5，125mm nacl和1mm dtt)平衡，然后用至少10柱体积的相同缓冲液洗涤，并用线性nacl梯度(0.125-1m)洗脱目的蛋白，将含有ttdago的洗脱液用50k超滤管进行超滤浓缩后，并在superdex 200 16/600柱(ge healthcare,boston,usa)上纯化。蛋白质用buffer b(20mm hepes ph7.5,500mm nacl,和1mm dtt)洗脱，洗脱得到的蛋白如图1所示(a1-a20泳道分别代表梯度浓度buffer b洗脱下来的蛋白)。用50k超滤管进行超滤浓缩后，在buffer b中稀释至最终浓度为8μm，分装至ep管中，在液氮中快速冷冻后，最后储存在-80℃。
49.sds-聚丙烯酰胺凝胶鉴定分析结果如图1所示，通过http://www.expasy.org/计算，ttdago的预期大小为87.75kda，其氨基酸序列如seq id no.1所示。所述ttdago与部分已表征的argonaute蛋白(ago蛋白)的进化树如图2所示，ttdago的催化dedx四联体以及与十七个已表征ago蛋白的序列比对示意图如图3所示。
50.实施例2ttdago对靶ssdna和靶ssrna切割活性测定
51.为了评估ttdago能够裂解向导dna/rna和靶dna/rna的哪些组合，对所有可能的组合进行了活性测定。其中靶ssdna(seq id no.3)、靶ssrna(seq id no.4)、向导ssdna(seq id no.5)和向导ssrna(seq id no.6)的序列示意图如图4所示，其中箭头表示预测的切割位点。
52.裂解试验均在75℃下以4:4:1(ttdago:向导:靶)摩尔比进行。将800nm ttdago与400nm向导放在含有10mm hepes-naoh ph 7.5，100mm nacl，5mm mncl2和5％甘油的反应缓冲液中混合，并在37℃孵育10分钟以用于向导加载，将核酸靶添加至200nm，75℃反应30min后，通过将样品与2
×
rna loading buffer(95％甲酰胺，18mm edta，0.025％ sds和0.025％溴酚蓝)混合并在95℃加热5分钟来终止反应。裂解产物通过20％变性page解析，用sybr gold(invitrogen)染色，用gel doc
tm xr+(bio-rad)可视化。
53.ttdago对靶ssdna和靶rna的切割结果如图5所示。结果显示：在没有核酸向导的情
况下(no guide泳道)进行孵育的靶ssdna/rna对照测定中未观察到产物带(34nt，序列如seq id no.7和8所示)，表明产物带的形成是ttdago核酸酶活性的结果；ttdago可以利用5’磷酸化的向导dna和5’羟基化的向导dna切割靶ssdna。
54.实施例3核酸向导长度对靶ssdna切割活性影响
55.分别选择长度为11～40nt的5’p-gdna以及5’oh-gdna作为向导dna(向导序列见表1)，按照实施例2中的裂解试验方法测定不同长度向导dna对ttdago识别并切割靶ssdna/的活性。
56.表1
[0057][0058]
测定结果如图6所示：对于5’p-gdna来说，14～40nt可以观察到产物，17～19nt的5’oh-gdna导致了高效的裂解；在5’oh-gdna的情况下，ttdago在guide优选长度为16～19nt时最活跃，在相对较长或较短的引导物上观察到较低的效率。根据ttdago相对最高的裂解效率，5’p-gdna和5’oh-gdna最合适的引导长度是18nt。
[0059]
实施例4二价金属离子及其浓度对靶ssdna切割活性影响
[0060]
将ttdago与5’p-gdna或5’oh-gdna放在含有10mm hepes-naoh ph 7.5，100mm nacl，5mm二价金属阳离子和5％甘油的反应缓冲液中混合，并在37℃孵育10分钟以用于向导加载，接着加入靶序列进行切割活性检测(向导序列、靶序列和检测过程同实施例2)。其中二价金属阳离子选自mn
2+
，mg
2+
，ca
2+
，cu
2+
，fe
2+
，co
2+
，zn
2+
和ni
2+
。
[0061]
测定结果如图7所示：二价金属阳离子的选择对于ttdago的切割活性有一定的影响，其中在mn
2+
条件下切割活性最好，其次是mg
2+
。
[0062]
进一步对二价金属离子的最低浓度进行摸索，分别选取0.01mm～10mm的mn
2+
或mg
2+
加入缓冲液中，75℃反应30min后测定ttdago对靶ssdna的切割活性。测定结果如图8所示：mn
2+
离子的测定显示，ttdago在0.02～10mm的浓度范围内具有活性，在mn
2+
浓度≥1.0mm时，裂解活性增加，且当向导为5’p-gdna时，其裂解效率高于5’oh-gdna；无论向导是5’p-gdna还是5’oh-gdna，ttdago在mg
2+
浓度≥2.5mm时都有活性，在2.5～10mm之间表现出同样的裂
解活性。
[0063]
实施例5温度对ttdago切割靶ssdna活性的影响
[0064]
参照实施例2，将ttdago与5’p-gdna或5’oh-gdna在37℃孵育10分钟孵育结合形成复合物后，添加靶ssdna，分别于30～95℃反应30min后，测定切割活性。
[0065]
结果如图9所示：无论guide是5’p-gdna或5’oh-gdna，ttdago的活性在30～37℃时没有明显差异，从45℃到75℃时裂解活性增强，然后在75℃以上的高温下活性下降；并且在75℃的条件下，5’p-gdna/5’oh-gdna介导的切割dna活性均是最好的。
[0066]
实施例6单碱基错配对ttdago切割靶ssdna活性的影响
[0067]
参照实施例2，将ttdago与5’p-gdna(18nt)孵育结合形成复合物后，添加靶ssdna，并使靶ssdna与向导dna发生单碱基错配，分别于75℃反应30min后，测定切割活性。
[0068]
检测结果如图10所示：其中m1表示位点1发生错配，m2表示位点2发生错配，依次类推至位点18，结果表明，当引入单核苷酸错配时，第8、9和11-15位的错配影响了裂解效率，但并没有导致裂解效率的急剧下降，只有第4和8位的错配使裂解效率下降了50％。
[0069]
实施例7ttdago催化活性位点突变
[0070]
图2已显示了ttdago催化四联体dedn，分别为seq id no:1所示序列的第534-542位、第572-581位、第604-612位和第721-729位。通过突变对ttdago蛋白的催化活性必不可少的一个或多个氨基酸残基以形成新的核酸酶活性，特别是核酸内切酶活性缺失。例如，对ttdago催化四联体:
[0071]
ivgidvtpm
[0072]
eqmgesidmk
[0073]
lilrdgkit
[0074]
vhyahkfvr
[0075]
第1个和第3个d突变为a，得到双突变体dm(序列如图3中ttdago_dm所示)，并测定其对于靶ssdna的切割活性。
[0076]
测定结果如图11所示：对ttdago的催化四连体进行突变后，会使其失去全部5’p-gdna或5’oh-gdna向导切割靶ssdna的活性；也就是说，至少突变一个位于进化保守的氨基酸四联体中的氨基酸，可改变ttdago蛋白的催化活性。即该四联体为ttdago催化活性关键位点。ttdago蛋白经突变失去核酸酶活性后，仍具有与单链向导dna的结合活性，可用于体外位点特异性靶向阻断靶dna。
[0077]
实施例8ttdago对靶dsdna切割活性测定
[0078]
为了测试ttdago是否体外对靶dsdna的切割活性，我们进行了体外质粒dna切割试验。fw(forward)向导(序列如seq id no.9所示)和rv(reverse)向导(序列如seq id no.10所示)部分互补，并对应于puc19质粒中一个gc含量(gc content)为56％的80bp(base pair)靶标区域，另外2个guide分别是nc(noncomplementary)guide 1(序列如seq id no.11所示)和nc guide 2(序列如seq id no.12所示)，它们的序列与puc19质粒的序列不存在重叠。靶dsdna和向导ssdna的序列示意图如图12所示，其中箭头表示预测的切割位点。
[0079]
75℃切割puc19质粒30分钟的结果如图13所示：在没有ttdago的情况下，观察到少量开环质粒(open circular plasmid，简称oc)，并未观察到线性化质粒(linearized plasmid，简称linear)；即使在没有向导的情况下，加入ttdago就会使质粒松弛，出现开环
质粒和线性化质粒。
[0080]
综上所述，本发明制备的ttdago蛋白质对单链向导dna(5’p-gdna，5’oh-gdna)具有结合活性，并对与单链向导dna互补配对的靶dna具有很高的核酸酶活性，能够进行体外的靶向dna编辑。
[0081]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。