FOXP1基因在卵巢功能保护中的应用

本发明涉及foxp1基因在诊断卵巢衰老和损伤中的应用，属于生物医学，具体地涉及一种foxp1基因在卵巢功能保护中的应用。

背景技术：

1、卵巢是女性的性腺器官，具有生殖与内分泌功能，在维持女性生育能力和身体健康中发挥着关键作用。随着女性年龄的增长，体内有害代谢产物不断堆积，卵巢内微环境改变，引起卵泡质量和数量逐渐下降，卵巢功能日益降低，从而影响生育能力和内分泌功能，出现围绝经期症状，进一步影响全身各系统，如骨质疏松、心脑血管发病率增加、泌尿系统萎缩等等。因此卵巢衰老的早发现、早治疗对女性生殖健康和整体健康至关重要。

2、目前应用于临床的卵巢衰老的诊断方式主要为反应卵巢内分泌功能的指标，如卵泡刺激素(fsh)、黄体生成素(lh)、抗米勒管激素(amh)、抑制素b等；此外，超声监测卵泡数量和卵巢血流、ct和磁共振等影像学手段也常用于辅助诊断。

3、由于卵巢衰老过程中，受遗传、环境、生活方式、社会心理等多种因素影响，这些因素在卵巢生长、发育、成熟和衰老过程中均发挥着重要作用。这些因素的复杂性，使卵巢功能的评价以及卵巢衰老的早期诊断极具挑战性。除了广泛应用的内分泌和影像学指标外，多种生物标志分子逐渐被发现和鉴定，随着分子生物学的发展，越来越多的研究聚焦于分子生物学层面，旨在发现更多潜在的生物标志物分子，从而更好的评估和预测卵巢衰老。

4、foxp1是一种控制多种细胞生长、分化、增殖途径的转录因子，在乳腺癌、淋巴瘤、胰腺癌、食管癌等肿瘤的发生发展以及神经系统疾病如自闭症等疾病中有所研究。目前只有一篇文献报道了在骨髓间充质干细胞中foxp1缺乏可导致骨骼过早老化，且foxp1在卵巢中的报道仅一篇卵巢癌相关研究，尚无foxp1与卵巢衰老相关的研究报道。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明公开了一种foxp1基因在卵巢功能保护中的应用。为研究卵巢衰老的分子机理提供新的思路。

2、为实现上述技术目的，本发明的第一个方面是公开了一种foxp1基因作为生物标志物在制备用于评估诊断卵巢功能试剂或试剂盒中的应用，用于扩增所述foxp1基因的引物包含foxp1-f、foxp1-r及gapdh-f、gapdh-r，其中各引物的序列如下：

3、foxp1-f：atgatgcaagaatctgggactg；

4、foxp1-r：agctggttgtttgtcattcctc；

5、gapdh-f：agcgtcaaaggtggaggagtgg；

6、gapdh-r：acatcaagaaggtggtgaagcagg。

7、其中gapdh-f与gapdh-r作为对比引物对。

8、在本发明的一些实施方式中，所述试剂或试剂盒中还包含：

9、2×chamq universal sybr qpcr master mix、双蒸水、cdna，且体积比如下：

10、2×chamq universal sybr qpcr master mix：foxp1-f：foxp1-r：双蒸水：cdna＝(2～20):0.5:0.5:(4～16):(0.5～2)，优选10:0.5:0.5:8:1；其中cdna为dna模板。

11、所述上游引物foxp1-f与下游引物foxp1-r的摩尔比为1:1。

12、在本发明的一些实施方式中，所述评估诊断包含如下步骤：

13、(1)收集废弃的正常卵巢组织；

14、(2)免疫组化处理；

15、(3)提取经所述步骤(2)处理后卵巢组织的总蛋白；

16、(4)提取所述步骤(3)中所述总蛋白的卵泡液颗粒细胞；

17、(5)提取所述步骤(4)中所述卵泡液颗粒细胞的rna：

18、(6)逆转录所述rna得dna模板，采用所述引物对在pcr反应体系内对dna模板进行扩增，对扩增产物采用统计学方法统计不同年龄段的卵巢组织中所述foxp1基因的表达。

19、在本发明的一些实施方式中，所述步骤(2)包括如下步骤：

20、(2.1)石蜡切片脱蜡至水；

21、(2.2)消除内源性过氧化物酶的活性；优选在质量百分比为1～5wt％的h2o2中室温孵育5～10min；

22、(2.3)蒸馏水冲洗，pbs浸泡处理；优选每次浸泡4～6min，浸泡1～3次；

23、(2.4)采用山羊血清室温孵育，去除血清以后滴加一抗工作液孵育；优选所述山羊血清为正常的山羊血清的pbs溶液，体积百分比为5～10％，优选孵育8～15min，且孵育后不再清洗就滴加一抗工作液，该一抗工作液为商品化成品，继续在37℃孵育1～2h；

24、(2.5)pbs冲洗；同步骤(2.3)，优选每次浸泡4～6min，浸泡2～5次；

25、(2.6)滴加二抗工作液孵育；所述二抗工作液为生物素标记，其也为商品化成品，在37℃孵育10～30min；

26、(2.7)pbs冲洗；同步骤(2.5)，优选每次浸泡4～6min，浸泡2～5次；

27、(2.8)滴加免疫组化检测试剂孵育；所述免疫组化检测试剂可以为辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，在37℃孵育10～30min；

28、(2.9)pbs冲洗；同步骤(2.3)与(2.5)，优选每次浸泡4～6min，浸泡2～5次；

29、(2.10)显色剂显色；所述显色剂为商品化常用显色剂，显色3～15min；

30、(2.11)冲洗，复染，脱水，透明，封片。其中，采用自来水充分冲洗。

31、在本发明的一些实施方式中，所述步骤(3)包括如下步骤：

32、(3.1)裂解蛋白，超声后收集上清液；包括将卵巢组织剪切，然后研磨呈匀浆状，再加入裂解液充分裂解，之后超声处理；所述裂解液为体积比为ripa：pmsf：磷酸酶抑制剂a：磷酸酶抑制剂b＝100：1：1：1的混合液；

33、(3.2)计算所述上清液的体积；

34、(3.3)采用蛋白浓度检测方法检测浓度；其中采用bca法；

35、(3.4)蛋白变性处理；

36、(3.5)western blot试验，包括如下步骤：

37、(3.51)根据目的蛋白分子量，选择凝胶配制试剂盒进行制胶；所述凝胶配制试剂盒优选为sds-page胶试剂盒；

38、(3.52)配置电泳缓冲液进行电泳，所述电泳缓冲液中包含tris-base、甘氨酸、sds与双蒸水；

39、(3.53)转膜；

40、(3.54)封闭；捞出膜后，置于质量百分比浓度为3％～8％的bsa中，封闭一段时间后，将膜置于一抗稀释液中，所述一抗稀释液为foxp1抗体稀释在质量百分比浓度为3％～8％的bsa中，体积比优选为1:1000；

41、(3.55)二抗孵育；取出步骤(3.54)中的膜，采用tbst洗涤，然后置于由tbst作为溶剂配置的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗中孵育，体积比优选为1:3000；

42、(3.56)曝光处理；

43、(3.57)采用图像处理软件处理并进行统计学分析，其中，图像处理软件为image j软件，统计学分析软件为spss20.0统计软件；

44、在本发明的一些实施方式中，所述步骤(6)中所述逆转录包括将所述rna置于逆转录反应体系内反应得dna模板，所述逆转录反应体系的反应条件包括：

45、50℃，15分钟；85℃，5秒；

46、所述逆转录反应体系包括逆转录试剂盒，向所述逆转录试剂盒的无酶管中配制rnase free ddh2o、4×gdna wiper mix及模板rna，用量比为32μl：8μl：2μg。

47、所述pcr反应体系的扩增条件包括：

48、95℃，30s：循环1次；

49、95℃，10s+60℃，30s：循环49次；

50、95℃，15s+60℃，60s+95℃，15s：循环1次。

51、在本发明的一些实施方式中，所述步骤(6)中所述对扩增产物采用统计学方法统计不同年龄段的卵巢组织中所述foxp1基因的表达包含：

52、不同年龄段的卵巢组织中所述foxp1基因的表达存在差异，其中，年龄大的卵巢组织中所述foxp1基因的表达低于年龄小的卵巢组织中所述foxp1基因的表达。

53、本发明的第二个方面是提供一种提高foxp1基因表达的试剂在制备用于预防和/或治疗卵巢功能下降药物中的应用。

54、在本发明的一些实施方式中，所述试剂用于拮抗抑制foxp1基因表达的试剂。其中，抑制foxp1基因表达的物质包含si-rna，所述si-rna的序列分别如下：

55、foxp1-si1：ggatctgaccacgacatgt；

56、foxp1-si1：gcgctggacgatagaagta；

57、foxp1-si3：gcaggccattctcgaatct。

58、在本发明的一些实施方式中，所述卵巢功能下降包含卵巢损伤或卵巢衰老。

59、其中，所述卵巢损伤和卵巢衰老包含：年龄、遗传、免疫、医源性、感染性、环境、行为学、社会心理等多种因素引起的卵巢损伤或衰老。

60、本发明实施例提供的技术方案与相关技术相比具有如下优点：

61、本发明通过试验探究发现foxp1基因表达在卵巢衰老、衰老中具备相关性，为研究卵巢衰老的分子机理提供新的思路，另一方面为早期卵巢衰老、损伤的诊断及保护卵巢功能药物的开发奠定了基础。