提高CAR-NK细胞阳性率的表达方法及LDL受体应用与流程

本发明涉及慢病毒转染、包装等，尤其涉及一种ldl受体基因及其应用。

背景技术：

1、肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。其中，恶性肿瘤因易发生转移，治疗后易复发且在某些特殊的微环境下导致极难治愈。

2、原代nk细胞对于基因转染的抵抗力较强，这导致nk细胞对多种载体系统的摄取率低，nk细胞的转基因表达量低，只有病毒载体在原代nk细胞中实现了较高的基因转移效率。为了提高病毒载体的安全性，已经创建了表达系统，其中包膜蛋白在单独的质粒上表达。这允许在称为假型化的过程中安全生成具有外源包膜蛋白的修饰病毒颗粒。增强nk细胞转导的一种方法是选择最佳假型包膜蛋白。常用的水泡性口炎病毒(vsv)糖蛋白g通常非常有效，因为它与存在于多种细胞中的ldl受体结合。然而，它对淋巴细胞的感染效率低下，并且由于nk细胞表面ldl受体表达量极低，即使使用高病毒滴度侵染，也无法有效提高侵染效率还往往对细胞有毒性。

3、近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法(act)，即指从病人体内分离出t细胞、nk细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。2013年，肿瘤的免疫疗法被science杂质评为“十大突破”之首。

4、car-t和tcr-t是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其car-t疗法，在血液肿瘤的治疗上取得了显著的成就，取得了较高的缓解率，典型的car结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scfv、铰链和跨膜结构域、胞内共刺激信号和激活结构域。第一代的car并不包含胞内共刺激信号，car-t细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。因此，第二代car开始加入共刺激信号如cd28和4-1bb，采用不同的共刺激信号的car-t细胞的特性也不尽相同，cd28增强了car-t细胞的杀伤活性而4-1bb则增强car-t细胞杀伤活性的同时延长了car-t细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代car，然而其抗肿瘤效果并不如二代car-t。因此，现在临床应的主要为二代car-t细胞。

5、带有car受体的nk细胞(car-nk)，被认为是一种有效的抗癌工具。最初，car-nk细胞的创建是使用为car-t细胞开发的结构进行的；然而，最近的发展已经纳入了对nk细胞的适应。然而，nk细胞带来了特殊和独特的问题。与t细胞和b细胞不同，nk细胞通常不会克隆扩增，这使得car-nk细胞的生成、维持和扩增具有挑战性。nk-car细胞生成中最重要的阶段是将遗传元件引入nk细胞本身以及随后的car-nk细胞扩增。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种可以在nk细胞表面瞬时过表达ldl受体，并可以有效提高慢病毒侵染效率的ldl受体基因。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种提高car-nk细胞阳性率的表达方法，包括如下步骤：

4、nk细胞激活并瞬时过表达ldl受体；

5、对过表达ldl受体的nk细胞进行慢病毒侵染。

6、nk细胞激活并瞬时过表达ldl受体，采用瞬转方式在已激活的nk细胞表面瞬时过表达ldl受体，且瞬转方式包括钙转法、lipo3000转染法、脂质体转染法及其他试剂盒转染法中的任一种。

7、对过表达ldl受体的nk细胞进行慢病毒侵染，采用慢病毒侵染方式在经过处理的nk细胞中表达car基因，且nk细胞激活方法包括抗体激活法、磁珠激活法、细胞刺激法、化学试剂法及其他试剂盒激活法中的任一种或多种组合；慢病毒包膜为水泡性口炎病毒糖蛋白g(vsv-g)，并且慢病毒中包含car基因。慢病毒包装过程包括三质粒系统、四质粒系统中的任一种。

8、一实施例，所述表达方法中，所述nk细胞激活并瞬时过表达ldl受体步骤中，还包括如下步骤：

9、从外周血中获取nk细胞，并按照5.0×105个细胞/孔的密度接种至24孔板中，并往24孔板中加入培养基进行nk细胞培养；

10、nk细胞培养16～18小时后，去除培养基，更换无血清培养基，孵育1小时；

11、将质粒转染混合液加入24孔板中，对nk细胞进行瞬时转染处理；

12、转染6小时后，去除24孔板中的混合液，更换完全培养基；转染48小时后，收集上清nk细胞悬浮液，此时nk细胞激活并瞬时过表达ldl受体。

13、一实施例，所述表达方法中，nk细胞无血清培养时，每5.0×105个细胞加入200～500μl无血清培养基。

14、一实施例，所述表达方法中，所述质粒转染混合液包括四质粒、lipo 3000和opti-mem，且lipo3000与四质粒总数按2:1(v/m)，opti-mem为100～300ul。

15、一实施例，所述表达方法中，所述对过表达ldl受体的nk细胞进行慢病毒侵染步骤中，还包括如下步骤：

16、往激活后的瞬转过表达ldl受体的nk细胞悬液中加入转染助转剂，获得nk细胞转染悬液；

17、往nk细胞转染悬液中加入慢病毒，进行慢病毒转染；

18、慢病毒转染完成后，加入完全培养基，对慢病毒转染的nk细胞进行培养；随后收集细胞悬液，备用。

19、一实施例，所述表达方法中，所述转染助转剂为polybrene助转剂或碱性氨基酸的无血清培养基；且每1ml nk细胞悬液添加2μl～20μl的转染助转剂。

20、一实施例，所述表达方法中，慢病毒转染步骤中，所述慢病毒的加入量为moi＝1～20，且转染时间为6～24小时。

21、一实施例，所述表达方法中，对慢病毒转染后的nk细胞进行培养时，完全培养基的加入量应保持细胞浓度为5.0×105个细胞/ml。

22、一实施例，所述表达方法中，所述完全培养基为含10～20％v/v fbs的完全培养基。

23、上述car基因包括二代、三代、四代、五代car；car结构靶向靶点包括cldn18.2、gucy2c、nectin4、gpc3、cd19、cd22中的任一种或多种。

24、上述表达方法中，所述ldl受体基因的核酸序列如seq id no:1所示；该ldl受体基因可以提高car-nk细胞阳性率。

25、一种载体，该载体包含ldl受体基因；较好的，所述载体包括质粒、dna或mrna。

26、一种表达盒，该表达盒包含ldl受体基因，或者包含上述载体。

27、一种重组微生物，该微生物包含ldl受体基因、上述载体或者上述表达盒

28、一种重组nk免疫细胞，该重组nk免疫细胞包含ldl受体基因、上述载体或者上述表达盒。

29、一实施例，所述重组nk免疫细胞结构中，在ldl受体基因前设有cmv或ef1a启动子，在ldl受体基因后设有egfp荧光基因；其中，ldl受体基因与egfp基因之间由蛋白分割元件分割，蛋白分割元件包括t2a、p2a、e2a、f2a及ires中的任一种。

30、一实施例，car-nk细胞中，质粒表达盒包括过表达ldl受体基因表达盒、慢病毒包膜基因表达盒及car基因表达盒中的一种或多种。

31、一种生物制剂，该生物制剂包含ldl受体基因、上述载体、上述表达盒，或者上述重组免疫细胞；且该生物制剂可以应用于制备治疗/预防肿瘤和/或癌症的药物。

32、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

33、1、在nk细胞表面瞬时过表达ldl受体，不影响nk细胞正常表型及发育过程；

34、2、有效提升nk细胞的侵染效率，解决nk细胞慢病毒侵染效率低下的问题；

35、3、侵染后的car-nk细胞保持良好杀伤能力，经过工艺优化可达到临床标准。

36、本发明提供的car-nk细胞制备方式，可以安全、方便、有效的制备出临床等级的car-nk细胞，并保证其拥有极高的阳性率和制备成功率，通过工艺优化保证其各项检测指标符合临床需求，并且完整保留其应有的功能及表型，具有极高的肿瘤清除效果。