一种基于PCR技术的扇贝品种鉴定方法及其特异性引物

一种基于pcr技术的扇贝品种鉴定方法及其特异性引物
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于pcr技术的扇贝品种鉴定方法及其特异性引物。


背景技术：

2.海湾扇贝(argopecten irradians)隶属瓣鳃纲(lamellibranchia)、珍珠贝目(pterioida)、扇贝科(pectinidae)，是我国1982年从美国大西洋沿岸引进的第一个argopecten属扇贝，由于其生长快，养殖周期短，深受养殖业户的欢迎，并由此引发了我国水产养殖业的又一个发展高潮，成为我国北方沿海主要扇贝养殖种类。紫扇贝(argopecten purpuratus)是原产于南太平洋的一种速生型中型扇贝，大小中等，广泛养殖于智利和秘鲁。紫扇贝和海湾扇贝同属于海湾扇贝属的优良品种，存在互补的性状，通过种间杂交有望培育出生长速度快、个体大且温度适应范围广的扇贝，为了改善海湾扇贝的种质，提高扇贝养殖业的经济产量，wang等于2008年从秘鲁引进紫扇贝并与海湾扇贝成功杂交，培育出了生长优势极其显著的杂交后代。虾夷扇贝(patinopecten yessoensis)原产于日本，是我国北方最重要的海水养殖贝类之一，目前已在渤海及黄海北部形成规模化养殖，近10年来创造了数十亿元的产值。栉孔扇贝(chlamys farreri)是我国的本土扇贝种，因其适温范围广，在黄渤海地区得到大面积推广养殖。
3.近年来，分子标记技术被广泛应用于种质鉴定、品种改良、遗传关系分析、系统发育等领域。利用来自核基因组的分子标记(如微卫星标记、aflp分子标记等)鉴定方法虽然可以用来进行物种鉴定，但是鉴定过程相对复杂且成本较高。因此开发一种简便地应用于海湾扇贝、紫扇贝、海湾与紫扇贝杂交一代(a.irradians
×
a.purpuratus)、虾夷扇贝、栉孔扇贝的鉴定方法是非常必要的。
4.专利文献cn106498086a公开一种紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代母本来源的鉴定方法，其基于线粒体dna序列的差异性设计了标记引物mtdna-z，并利用该引物进行pcr扩增，可以快速高效地鉴定出紫扇贝与海湾扇贝及其回交后代的亲本来源。然而该文献所提供的引物及鉴定方法只能用于紫扇贝、海湾扇贝与回交扇贝的鉴定，尚不能鉴定扇贝其他品种。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种海湾扇贝、紫扇贝、海湾与紫扇贝杂交一代、虾夷扇贝、栉孔扇贝的鉴定方法。品种鉴定的特异性引物是基于不同物种基因内含子长度差异来设计的。我们选择了内参基因ef1a，该基因第一个外显子和第二个外显子之间的内含子长度存在明显差异(图1)，而且该基因属于管家基因，在不同物种中外显子序列保守。相比较于aflp分子标记等方法，该方法不需要酶切，仅通过pcr引物扩增就可以实现对上述品种的初步鉴定，简单有效且成本低廉，能快速进行鉴定。
6.本发明所采用的技术方案如下：
7.本发明首先提供了一种用于鉴定海湾扇贝、紫扇贝、海湾与紫扇贝杂交一代、虾夷扇贝、栉孔扇贝等扇贝品种的引物hz，由左端引物序列hz-f:5
’‑
cattaacatcgtggtcattggc-3’和右端引物序列hz-r：5
’‑
agtttgtccaacacccaggc-3’组成。
8.另一方面，本发明还提供一种基于pcr技术的扇贝品种鉴定方法，包括以下步骤：
9.以扇贝全基因组dna为模板，使用所述引物hz进行pcr扩增；对pcr产物进行电泳；根据pcr产物的电泳条带鉴定扇贝品种。
10.优选的，所述根据pcr产物的条带鉴定扇贝品种的方法是：
11.如果在600bp处有特异性条带，则证明此扇贝为海湾扇贝；
12.如果在1000bp处有特异性条带，则证明此扇贝为紫扇贝；
13.如果在600bp和1000bp处各有一条特异性条带，则证明此扇贝为海湾扇贝与紫扇贝的杂交一代扇贝；
14.如果在900bp处有特异性条带，则证明此扇贝为虾夷扇贝；
15.如果在500bp处有特异性条带，则证明此扇贝为栉孔扇贝。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17.(1)本发明的特异性引物能够快速简便地鉴别出海湾扇贝、紫扇贝、海湾与紫扇贝杂交一代、虾夷扇贝、栉孔扇贝等多个扇贝品种。
18.(2)本发明提供的鉴定方法，仅需提取扇贝的基因组dna，并利用特异性引物hz进行pcr扩增，pcr产物经电泳后即可实现对多种扇贝品种的鉴定。相比较于aflp分子标记等方法，该方法不需要酶切，仅通过pcr扩增即可实现扇贝品种鉴定，简单有效且成本低廉。
附图说明
19.图1：内参基因ef1a内含子长度差异图。
20.图2：实施例1鉴定结果图，上图为海湾扇贝(a.irradians)鉴定结果，下图为紫扇贝(a.purpuratus)鉴定结果。
21.图3：实施例2鉴定结果图。
22.图4：实施例3鉴定结果图，上图为栉孔扇贝(c.farreri)鉴定结果，下图为虾夷扇贝(p.yessoensis)鉴定结果。
具体实施方式
23.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
24.下述实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。
25.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.实施例1：
27.以海湾扇贝(a.irradians)、紫扇贝(a.purpuratus)为例，采用本发明方法进行鉴定。
28.所用的特异性扩增引物为hz，分别由左端引物序列hz-f:5
’‑
cattaacatcgtggtcattggc-3’和右端引物序列hz-r：5
’‑
agtttgtccaacacccaggc-3’组成。
29.鉴定步骤如下：
30.(1)分别取7个紫扇贝和7个海湾扇贝的外套膜，直接用天根dna提取试剂盒(天根
生化科技有限公司，北京)提取全基因组dna，用depc(焦碳酸二乙酯)稀释，保存在-20℃备用，然后经1％琼脂糖凝胶电泳，gelred核酸染料染色，采用凝胶成像系统照相观察以确保提取的全基因组dna的纯度和质量符合要求。
31.(2)以上述提取的海湾扇贝和紫扇贝的dna为模板，用上述引物hz对其进行pcr扩增。反应体系为20μl：10μl taq plus master mix，8.6μl depc，1μldna模板，上下游引物各0.2μl；反应程序为：95℃预变性3min，95℃15s，60℃20s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；
32.(3)pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，gelred核酸染料染色，凝胶成像系统照相观察。电泳结果表明(图2)，所有的海湾扇贝均在600bp附近扩增处明显的条带，所有的紫扇贝均在1000bp附近扩增出明显的条带，大小与预期的条带相符合，证明该引物能够准确鉴定海湾扇贝与紫扇贝。
33.实施例2
34.以海湾扇贝与紫扇贝的杂交一代(a.irradians
×
a.purpuratus)为例，进行鉴定。
35.鉴定步骤如下：
36.(1)取5个海湾扇贝与紫扇贝的杂交一代个体的外套膜，直接用天根dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全基因组dna，用depc稀释，保存在-20℃备用，然后经1％琼脂糖凝胶电泳，gelred核酸染料染色，凝胶成像系统照相观察以确保提取的全基因组dna的纯度和质量符合要求。
37.(2)以上述提取的杂交扇贝的dna为模板，用上述引物hz对其进行pcr扩增，反应体系为20μl：10μl taq plus master mix，8.6μl depc,1μl dna模板，上下游引物各0.2μl；反应程序为：95℃预变性3min，95℃15s，60℃
38.20s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；
39.(3)pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，gelred核酸染料染色，凝胶成像系统照相观察。电泳结果表明(图3)，所有的杂交扇贝均出现两条扩增条带，一条在600bp附近，一条在1000bp附近，大小与预期的条带相符合，证明该引物能够准确鉴定海湾扇贝与紫扇贝的杂交一代。
40.实施例3
41.以栉孔扇贝(c.farreri)、虾夷扇贝(p.yessoensis)为例，进行鉴定。
42.鉴定步骤如下：
43.(1)分别取7个栉孔扇贝和7个虾夷扇贝的外套膜，直接用天根dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全基因组dna，用depc稀释，保存在-20℃备用，然后经1％琼脂糖凝胶电泳，gelred核酸染料染色，凝胶成像系统照相观察以确保提取的全基因组dna的纯度和质量符合要求。
44.(2)以上述提取的栉孔扇贝和虾夷扇贝的dna为模板，用上述引物hz对其进行pcr扩增，反应体系为20μl：10μl taq plus master mix，8.6μl depc，1μldna模板，上下游引物各0.2μl；反应程序为：95℃预变性3min，95℃15s，60℃20s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；
45.(3)pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，gelred核酸染料染色，凝胶成像系统照相观察。电泳结果表明(图4)，所有的栉孔扇贝均在500bp附近扩增出明显的条带，所有的虾夷扇
贝均在900bp附近扩增处明显的条带，大小与预期的条带相符合，证明该引物能够准确鉴定栉孔扇贝和虾夷扇贝。
46.上述内容仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。