检测猫白血病病毒的试剂盒、引物组、探针、检测方法与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种检测猫白血病病毒的试剂盒、引物组、探针、检测方法。


背景技术：

2.猫白血病病毒(feline leukemia virus，felv)属于逆转录病毒科c型肿瘤病毒属，为有囊膜的单链rna病毒。felv可在家猫中流行，引起组织细胞增殖、蜕变和免疫抑制。felv感染虽然无性别和品种差异，但不同年龄猫易感性不同，新生仔猫最易感，4月龄以上猫感染率相对较低，felv感染猫90％以上终身带毒。felv主要经呼吸道和消化道传播，在口、鼻分泌物中含量最高；另外，在患病猫尿液和乳汁中可检测到病毒，故猫呼吸理毛行为、共用食槽和饮水槽可相互传染本病毒；felv也可经胎盘垂直传播，常在被感染动物出现造血系统肿瘤之前，导致孕猫流产或新生猫致死性侏儒症。目前实验室诊断felv的方法有：病毒分离鉴定、免疫层析、免疫荧光、pcr、elisa等。其中临床常用的检测方法为rt-pcr。pcr技术因特异性强、费用低等优点已成为一种经典的检测方法，广泛用于猫白血病病毒的检测。
3.但目前的felv检测灵敏度较低，基于此，有必要对现有的felv检测进行改进。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提出了一种检测猫白血病病毒的试剂盒、引物组、探针、检测方法，以解决或部分解决现有技术中存在的问题。
5.第一方面，本发明提供了一种猫白血病病毒检测用引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物；
6.其中，所述正向引物的核酸序列为5
’‑
agttcgaccttccgcctcat-3’；
7.所述反向引物的核酸引物序列为5
’‑
agaaagcgcgcgtacagaag-3’。
8.第二方面，本发明还提供了一种与所述引物组配合使用的探针，所述探针的核酸序列为5
’‑
taaactaaccaatccccatgqcctctcgc-3’。
9.优选的是，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
10.优选的是，所述荧光报告基团选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red、lc red460中的一种；
11.和/或，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
12.第三方面，本发明还提供了一种检测猫白血病病毒的试剂盒，包括所述的引物组以及所述的探针。
13.优选的是，所述的试剂盒，还包括mgcl2、tris、bsa和dntps。
14.优选的是，所述的试剂盒，包括1～3mm mgcl2、40～60mm tris、450～550mg/lbsa、90～110μm dntps、0.05～0.2μm正向引物、0.05～0.2μm正向引物、0.05～0.2μm探针。
15.优选的是，所述的试剂盒，还包括酶混合液，所述酶混合液包括rna酶抑制剂、逆转
录酶、taq酶。
16.第四方面，本发明还提供了一所述的试剂盒在制备猫白血病病毒检测试剂中的应用。
17.第五方面，本发明还提供了一种用于以非诊断目的猫白血病病毒检测方法，包括以下步骤：
18.获取待测样本的核酸提取物；
19.向核酸提取物加入所述的试剂盒进行pcr扩增反应；
20.根据荧光信号进行判断得出结果。
21.本发明的检测猫白血病病毒的试剂盒、引物组、探针、检测方法相对于现有技术具有以下技术效果：
22.本发明的猫白血病病毒检测用引物组，包括正向引物、反向引物，正向引物的核酸序列如seq id no.1所示，反向引物的核酸引物序列如seq id no.2所示；正向引物、反向引物之间以及正向引物、反向引物与其它病毒之间无交叉反应，利用本技术的引物组检测猫白血病病毒具有良好的特异性、灵敏度高以及检测结果可靠等优点；本发明的试剂盒包括引物组和探针，该试剂盒可用于检测猫白血病病毒，该试剂盒具有特异性高、重复性好、灵敏度高、检测结果可靠等优点；采用本发明的试剂盒对猫白血病病毒的检测，所达到的最低检测限超过现有现有技术中检测felv的最高水平，本试剂盒检测灵敏度可达500copies/μl以下；本发明的试剂盒可用于临床猫白血病病毒的快速诊断和流行病学调查，具有较高的实用性。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明实施例2中猫白血病病毒检测的荧光扩增曲线。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
26.本技术实施例提供了一种猫白血病病毒检测用引物组，引物组包括正向引物和反向引物；
27.其中，正向引物的核酸序列为5
’‑
agttcgaccttccgcctcat-3’；
28.所述反向引物的核酸引物序列为5
’‑
agaaagcgcgcgtacagaag-3’。
29.本技术设计的正向引物、反向引物之间以及正向引物、反向引物与其它病毒之间无交叉反应，利用本技术的引物组检测猫白血病病毒具有良好的特异性、灵敏度高以及检测结果可靠等优点。
30.基于同一发明构思，本技术实施例还提供了一种与上述引物组配合使用的探针，探针的核酸序列为5
’‑
taaactaaccaatccccatgqcctctcgc-3’。
31.具体的，本技术的所用的引物组、探针的核酸序列如下表1所示。
32.表1-引物组、探针的核酸序列
33.名称核酸序列(5
’‑3’
)正向引物agttcgaccttccgcctcat反向引物agaaagcgcgcgtacagaag探针taaactaaccaatccccatgqcctctcgc
34.在一些实施例中，探针的5’端标记有荧光报告基团，探针的3’端标记有荧光淬灭基团，即本技术的探针为特异性荧光探针。
35.在一些实施例中，荧光报告基团选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red、lc red460中的一种。
36.在一些实施例中，荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2或bhq3中的一种。
37.基于同一发明构思，本技术还提供了一种检测猫白血病病毒的试剂盒，包括上述的引物组以及上述的探针。
38.在一些实施例中，上述的试剂盒，还包括mgcl2、tris、bsa和dntps。
39.在一些实施例中，上述的试剂盒包括1～3mm mgcl2、40～60mm tris、450～550mg/l bsa、90～110μm dntps、0.05～0.2μm正向引物、0.05～0.2μm正向引物、0.05～0.2μm探针。
40.上述实施例中，tris缓冲液ph为8～9，优选的，tris缓冲液ph为8.3。
41.在一些实施例中，上述的试剂盒包括2mm mgcl2、50mm tris(ph为8.3)、500mg/l bsa、100μm dntps、0.1μm正向引物、0.1μm正向引物、0.1μm探针。
42.在一些实施例中，上述的试剂盒酶混合液，酶混合液包括rna酶抑制剂、逆转录酶、taq酶。
43.在一些实施例中，酶混合液包括35～45u/μl的rna酶抑制剂、20～30u/μl的逆转录酶、3～7u/μl的taq酶；优选的，酶混合液包括40u/μl的rna酶抑制剂、25u/μl的逆转录酶、5u/μl的taq酶。
44.在一些实施例中，试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，具体的，阳性对照为临床收集的猫白血病病毒强阳性样本，阴性对照为超纯水。
45.本技术的试剂盒可用于检测猫白血病病毒，该试剂盒具有特异性高、重复性好、灵敏度高、检测结果准确、检测时间短、检测结果可靠等优点；采用本技术的试剂盒对猫白血病病毒的检测，所达到的最低检测限超过现有现有技术中检测felv的最高水平，本试剂盒检测灵敏度可达500copies/μl以下。本技术的试剂盒可用于临床猫白血病病毒的快速诊断和流行病学调查,具有较高的实用性。
46.基于同一发明构思，本技术实施例还提供了一种上述的试剂盒在制备猫白血病病毒检测试剂中的应用。
47.基于同一发明构思，本技术实施例还提供了一种用于以非诊断目的猫白血病病毒检测方法，包括以下步骤：
48.s1、获取待测样本的核酸提取物；
dntps、0.1μm正向引物、0.1μm正向引物、0.1μm探针；
67.正向引物的核酸序列为5
’‑
agttcgaccttccgcctcat-3’；
68.反向引物的核酸引物序列为5
’‑
agaaagcgcgcgtacagaag-3’；
69.探针的核酸序列为5
’‑
taaactaaccaatccccatgqcctctcgc-3’；
70.探针的5’端标记有荧光报告基团fam，探针的3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；
71.(2)酶混合液，其包括40u/μl的rna酶抑制剂、25u/μl的逆转录酶、5u/μl的taq酶；
72.(3)阳性对照和阴性对照，阳性对照为临床收集的猫白血病病毒强阳性样本，阴性对照为超纯水。
73.实施例2
74.本技术实施例提供了一种用于以非诊断目的猫白血病病毒检测方法(采用实施例1中的试剂盒进行检测)，包括以下步骤：
75.s1、根据待测样本、阴性对照样本、阳性对照样本的数量，按比例取相应量的实施例1中的pcr反应液(2.9μl/份)、酶混合液(0.1μl份)，充分混匀成pcr-mix；瞬时离心后备用；
76.s2、按向pcr-mix反应液中分别加入2μl的阴性对照样本、阳性对照样本、待测样本核酸提取物、盖紧反应管转移至pcr扩增区，将各反应管按一定顺序放入q3 plus荧光定量pcr仪上，按表2程序进行pcr扩增。
77.按照实施例2中的方法得到的荧光扩增曲线如图1所示。图1中1为猫白血病病毒阳性检测结果，2为猫白血病病毒阴性检测结果，3为阈值线。
78.上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。