一种生产D-阿洛酮糖-3差向异构酶的补料培养基及补料方法与流程

本发明涉及微生物发酵，更具体地说是涉及生产d-阿洛酮糖-3差向异构酶的一种补料培养基及补料方法。

背景技术：

1、d-阿洛酮糖是一种作为稀少糖，由于其甜度是蔗糖的70％左右，而能量值不到蔗糖10％，它为糖尿病人和肥胖人群提供了传统糖制品的替代品，因此，d-阿洛酮糖备受关注。目前，生产d-阿洛酮糖的技术主要包括提取法、化学合成法和生物转化法。但是d-阿洛酮糖在自然界中的含量极低，提取法明显不适宜d-阿洛酮糖的大规模生产；化学合成法不仅成本高、产量低，而且会产生比较严重的环境污染。生物转化法可以利用自然界广泛存在的单糖或某些单糖的加工副产物为原料，不仅成本较低，而且转化效率也远远高于提取法，是规模化制备d-阿洛酮糖的重要技术手段。

2、生物转化法中，通过d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-psicose3-epime-rase，dpe，ec5.3.1.3)催化d-果糖的c-3位置的差向异构化制备d-阿洛酮糖有许多优势，例如简单的纯化过程和较高的产物浓度。现有技术中多为对d-阿洛酮糖3-差向异构酶进行基因重组或克隆的异源表达以及细胞的固定化的研究，而目前生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶仍存在酶活较低，半衰期短、生产时间长、成本高等问题。

3、因此，提供一种提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种生产d-阿洛酮糖-3差向异构酶的补料培养基及其补料方法，通过添加不同比例的葡萄糖、玉米浆、黄豆饼粉和微量元素，配制成具有一定碳氮比且同时具有速效氮源、迟效氮源及微量元素的补料培养基，通过ph-溶氧-补料反馈调节，达到提高菌种浓度和目的蛋白酶活性的目的。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种生产d-阿洛酮糖-3差向异构酶的补料培养基，由如下原料组成：葡萄糖、玉米浆、黄豆饼粉和微量元素，其中微量元素相对于葡萄糖的添加量为0.15-0.5g/l，黄豆饼粉和玉米浆和的比例m:v为(50-100)：1，最终混合补料碳氮比为(5-10):1，ph为4.06-4.51。

4、葡萄糖中葡萄糖纯度为30％-35％，还包括麦芽糖、果糖等其他物质，可为发酵生产提供碳源。玉米浆主要营养成分包括蛋白质、氨基酸、还原糖、维生素、乳酸等，在发酵生产中可以提供速效氮源和生长因子，促进微生物的生长繁殖；黄豆饼粉中的蛋白质常以大分子形式存在，微生物利用速度慢，常作为迟效氮源，有利于代谢产物的生成。

5、进一步地，所述葡萄糖ds(可溶性物质含量)为30-35、ph为4.0-4.5；所述车间玉米浆波美度为17-20、ph为4.0-5.0，蛋白质含量为150-200g/l；所述车间黄豆饼粉总蛋白质含量为50-55％；所述微量元素为氯化锰、氯化钴和硫酸镁中的任一种。

6、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护生产d-阿洛酮糖-3差向异构酶的补料培养基的制备方法，过程包括：(1)先将微量元素按比例溶于车间葡萄糖中，115℃灭菌20-25min，得混合液1；(2)再将黄豆饼粉按比例溶于车间玉米浆中，115℃灭菌20-25min，得混合液2；(3)在无菌条件下将上述两者混合液合并与补料瓶中，配制成补料培养基。

7、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护补料培养基在进行补料中的应用。

8、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护对生产d-阿洛酮糖-3差向异构酶的培养基进行补料的方法，其特征在于，建立ph-溶氧-补料偶联调控发酵机制，具体步骤如下：

9、(1)将重组枯草芽孢杆菌按1％的接种量接种在lb培养基中，37℃、转速220rpm摇瓶培养6-10h，得到种子液，测其od600nm＝2.08-6.04；

10、(2)将种子液接种于发酵培养基中培养发酵，发酵初始ph值为6.02-6.5；该阶段通过控制do使od600nm以1-3/h增长，控制发酵参数：温度37℃，通风比0.5vvm，罐压0.02或0.05mpa，转速150或200r/min；

11、(3)发酵至od600nm＝5.04-14.97时，初始配料中的葡萄糖耗尽，溶氧回升至20.0％以上，开始流加补料；流加补料后，溶氧降至20％以下，进入菌体快速增长阶段，控制ph以0.05-0.11/h下降，补料流加速度为100-150g/l；本阶段控制发酵参数：温度37±0.5℃，罐压0.02～0.05mpa，通过调节转速和风量控制do10～20％；溶氧回升至20.0％以上时，说明初始葡萄糖耗尽，是开始补料的标志；溶氧低于20.0％时也可以补料，但是此时不知道初始葡萄糖剩余量，不好控制补料速度；

12、控制ph的下降速度是因为下降速度过快会导致菌od600nm增长慢，下降速度过慢会导致时间延长；控制ph的回升速度是因为回升速度过快会导致产酶量少，回升速度过慢会导致时间延长。

13、可以在原理中进行说明

14、(4)发酵15-25h，ph不再下降，进入d-阿洛酮糖-3差向异构酶生产阶段，控制ph以0.11-0.25/h回升，补料流加速度为100-170g/l；本阶段控制发酵参数：温度37±0.5℃，罐压0.02～0.05mpa，通过调节转速和风量控制do10～20％；

15、(5)发酵38-45h，ph回升至8.02-8.51，od600nm＝151.4-197.4，停止流加补料；

16、(6)发酵45-50h，溶氧回升至40％以上，hplc检测胞外酶活达到801.2-1002.3u/ml，结束发酵；停止流加补料时菌体破碎释放出大量酶，溶氧回升至40％以上时胞外酶活达到最高值，为结束发酵时间点；

17、(7)发酵液离心得到粗酶液。

18、有研究表明，do值较低时影响菌体代谢，而过高的do值虽然可以使菌体迅速生长，但是容易导致菌体衰老，产量下降。枯草芽抱杆菌是好氧菌，控制发酵过程的中的do值对于菌体发酵和产酶具有重要作用的；ph可以影响菌体细胞膜的通透性和代谢，进而影响发酵进程；补料时间太迟菌体发酵过程中不利产物的积累一定程度上影响了菌体对补料的吸收。本发明通过ph-溶氧-补料反馈调节，分别在菌体快速增长阶段和代谢产酶阶段，通过od600nm值和ph变化速度监测菌体生长代谢情况，动态调控do和补料流加速度，以及温度等发酵条件，以实现提高菌种浓度和目的蛋白酶活性的目的。

19、作为上述技术方案优选的技术方案，步骤(1)所述重组枯草芽孢杆菌是将dpe基因来源于(clostridiumscindensatcc35704；重组菌由天津工业生物技术研究所构建)构建重组质粒，将重组质粒转入枯草芽孢杆菌感受态细胞得到。

20、枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，是传统的工业生产菌，其生产的蛋白可以被大量释放到培养基中，从而大大缩减下游的蛋白纯化过程，显著降低目标蛋白生产成本，而且枯草芽孢杆菌细胞壁结构简单且不含内毒素，美国fda已将其列为gras(generallyrecognized as safe)级别的微生物。因此，采用枯草芽孢杆菌进行d-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产比dpease酶类常用宿主-大肠杆菌具有更大的优势。

21、作为上述技术方案优选的技术方案，步骤(2)中发酵培养基的制备过程为：将100g磷酸二氢钾，80g氯化铵，50g磷酸氢二钠、100g车间葡萄糖，2ml聚氧丙烯甘油醚和水9l混合并加入15l发酵罐中，115℃灭菌20-30min，将灭菌后的发酵罐进循环水冷却至37℃，获得发酵培养基。

22、综上所述，本发明达到的技术效果是：

23、1)本发明实现了50h内胞外酶活800-1000u/ml，克服了目前使用枯草芽孢杆菌作为宿主生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶普遍存在酶活低(100u/ml左右)，生产时间长的缺点，且本发明使用gras宿主生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶，符合国家对于食品安全的要求。

24、2)本发明制作的混合补料不仅能够为重组枯草芽孢杆菌生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶提供充足的碳源、速效氮源、迟效氮源与微量元素及生长因子，而且发酵培养基以葡萄糖、玉米浆和黄豆饼粉作为混合补料的原料具有简单易得，价格低廉的特点，与以酵母粉、蛋白胨等作为发酵培养基的其他发明相比在成本方面更具优势。

25、3)本发明通过流加的方式进行补料，同时结合发酵过程中ph-溶氧-补料偶联调控，发明了一种适合枯草芽孢杆菌高密度生长的补料方式，极大提高了菌体浓度，不仅缩短了发酵周期也提高了目的酶活性。