一种重组球孢白僵菌及其制备方法和应用

本发明涉及生物防治。具体地，涉及一种重组球孢白僵菌及其制备方法和应用。

背景技术：

1、寄生蜂是治理许多农林生态系统害虫的重要的天敌资源，它的毒液蛋白是天然存在的生物农药库，在害虫的生物防治中具有非常广阔的应用前景。寄生蜂的毒液蛋白具有以下优点：首先，杀虫效率高，寄生蜂和寄主害虫经过长期的协同进化，在自然选择的压力下，寄生蜂的某些毒液蛋白形成非常高效的毒力因子，且寄主不易产生抗药性。其次，专一性强，它不同于蜜蜂、胡蜂等蜂毒。寄生蜂的毒液蛋白对人畜等高等动物完全无害，并且不会伤害蜜蜂、蝴蝶、蜻蜓等生态系统中的益虫，只针对寄主害虫具有明显的致死作用。最后，绿色环保，蜂毒来源于昆虫，不污染环境，可降解。寄生蜂的毒液在害虫生物防治上可以作为增效剂。利用寄生蜂的毒液处理昆虫病原真菌，昆虫杆状病毒，以及微孢子虫，寄主害虫对这些生物农药的敏感性均显著提高，获得更好的杀虫效果。中红侧沟茧蜂(microplitismediator)是一种鳞翅目幼虫的寄生蜂，寄主包括棉铃虫(helicoverpa armigera)、粘虫(pseudaletia separata)、甘蓝夜蛾(mamestra brassicae)等四十多种重要的农业害虫。在新疆、河北等地曾进行野外施放，都取得了较好的生物防治效果。近期，通过转录组和蛋白质组相结合的方式，解析了中红侧沟茧蜂毒液蛋白的主要成分，并从中鉴定到了一种蛇毒类似的金属蛋白酶mmvrf1。在寄主体内注射极其微小剂量(1×10-4ng)的mmvrf1重组蛋白，即可直接杀死寄主幼虫。然而寄生蜂的体型较小，通过寄生蜂获取毒液并大规模应用的难度较大。

2、球孢白僵菌(beauveria bassiana)是一种昆虫病原真菌，寄主包括15目、149科的750余种昆虫和6科的13种蜱螨，是常用的生防菌，具有杀虫谱较广，易于大规模生产，对环境无害等优点。但是球孢白僵菌在生物防治的应用过程中依旧存在一些弊端，主要是杀虫起效缓慢，并且菌株防治效果不稳定。

3、因此，结合白僵菌和寄生蜂的优缺点，利用现代分子生物学的技术手段，开发出高效、低毒、绿色及稳定的新型杀虫剂以符合国家的发展需求，意义深远。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种重组球孢白僵菌，可以高效表达寄生蜂毒液蛋白mmvrf1，克服了球孢白僵菌起效慢，毒性弱的缺点。

2、本发明的第二个目的在于提供上述重组球孢白僵菌的应用。

3、本发明的第三个目的在于提供上述重组球孢白僵菌的制备方法，该制备方法操作简便，得到的球孢白僵菌非常稳定，外源毒力因子可持续表达。

4、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

5、第一方面，本发明提供了一种重组球孢白僵菌，其能够表达寄生蜂毒液蛋白。

6、示例性的，所述重组球孢白僵菌整合有外源的编码寄生蜂毒液蛋白的基因，所述编码寄生蜂毒液蛋白的基因为如下任一所述的核苷酸序列：

7、a1)seq id no.1第67-1449位的核苷酸序列；

8、b1)seq id no.2第67-1449位的核苷酸序列；

9、c1)上述a1)或b1)的互补序列；

10、d1)由于遗传密码简并性而从seq id no.1或seq id no.2的核苷酸序列衍生的多核苷酸。

11、优选的，所述重组球孢白僵菌中，在外源的编码寄生蜂毒液蛋白的基因前整合有内源的编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因，所述编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因如下任一所述的核苷酸序列：

12、a2)seq id no.3的核苷酸序列；

13、b2)上述a2)的互补序列；或

14、c2)由于遗传密码简并性而从seq id no.3的核苷酸衍生的多核苷酸。

15、本发明寄生蜂毒液蛋白具体为中红侧沟茧蜂毒液蛋白，编码寄生蜂毒液蛋白的基因和编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因可以人工合成，也可以利用pcr技术扩增获得。本发明将寄生蜂毒液蛋白自身信号肽去掉替换成了球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽，即在编码寄生蜂毒液蛋白的基因前整合内源的编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因，使重组球孢白僵菌能异源分泌表达寄生蜂毒液蛋白。

16、示例性地，本发明重组球孢白僵菌的保藏编号为cgmcc no.23043，分类命名为球孢白僵菌beauveria bassiana，于2021年7月14日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

17、第二方面，本发明提供了一种杀虫剂，其包括上述重组球孢白僵菌，或其后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体或它们之间的任意组合。

18、优选地，所述杀虫剂还包括农药学上可接受的载体；农药学上可接受的载体可为云母粉、轻质碳酸钙、陶土、滑石粉、高岭土、硅藻土、凹凸棒土、膨润土、海泡石、尿素、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵中的一种或多种。

19、在本发明具体实施方式中，所述杀虫剂用于防治棉铃虫和/或草地贪夜蛾。

20、上述重组球孢白僵菌、或所述重组球孢白僵菌的后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体、或它们之间的任意组合在制备杀虫剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

21、优选地，本发明的杀虫剂还可以包含其他能够杀虫的活性成分。示例性的，如绿僵菌素、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、类烟碱类、神经钠通道阻断剂、杀虫的巨环内酯、γ-氨基丁酸(gaba)拮抗剂、杀虫脲类和保幼激素模拟物中的一种或多种。

22、第三方面，本发明提供了重组球孢白僵菌的制备方法，包括如下步骤：将编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因和编码寄生蜂毒液蛋白的基因可操作性地导入球孢白僵菌中。

23、优选地，所述导入是通过农杆菌介导法进行的。

24、在本发明具体的实施方式中，所述重组球孢白僵菌的制备方法为：

25、将编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因和编码寄生蜂毒液蛋白的基因连接到表达载体上，通过农杆菌介导法导入球孢白僵菌中以将编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因和编码寄生蜂毒液蛋白的基因整合到球孢白僵菌的染色体上，得到能够表达寄生蜂毒液蛋白的球孢白僵菌工程菌株，即重组球孢白僵菌。

26、在本发明优选的实施方式中，所述重组球孢白僵菌的制备方法为：

27、将编码球孢白僵菌几丁质酶chit1信号肽的基因(bbsp)和编码寄生蜂毒液蛋白的基因(vrf1)连接到质粒pbargpe1上，得到pbargpe1-bbsp-vrf1-flag，获得包含真菌过表达启动子gpda promotor及终止子trpc terminator的cassette“gpda promotor-bbsp-vrf1-flag-trpc terminator”(简称为gbvft)，以利用启动子gpda promotor启动外源的寄生蜂毒液蛋白的基因的表达；

28、将gbvft连接到质粒ppk2-bar上，得到ppk2-bar-gbvft；

29、ppk2-bar-gbvft通过农杆菌介导法导入到球孢白僵菌中，得到能够表达寄生蜂毒液蛋白的重组球孢白僵菌工程菌株。

30、本发明还提供了一种杀虫的方法，其包括施用上述重组球孢白僵菌、或所述重组球孢白僵菌的后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体或它们之间的任意组合，或上述杀虫剂，或由上述制备方法制备的重组球孢白僵菌的步骤。

31、优选地，所述施用包括将用本发明的重组球孢白僵菌喷洒至农作物，例如玉米、小麦等。

32、本发明重组球孢白僵菌工程菌株相较野生型球孢白僵菌菌株，其对棉铃虫的致死中剂量降低了1.67倍(实验剂量梯度：1×102、1×103、1×104个孢子)，致死中时间缩短了1.55倍(在实验剂量为1×104个孢子的条件下)，杀虫效力有显著的提升。

33、本发明的有益效果如下：

34、1、本发明根据球孢白僵菌的密码子偏好性优化了寄生蜂毒液蛋白的基因序列，拓展用于生物防治的毒力因子资源库，将该序列整合到球孢白僵菌得到的重组球孢白僵菌，可以高效表达寄生蜂毒液蛋白，克服了生防菌起效慢，毒性弱的缺点。

35、2、本发明重组球孢白僵菌的制备方法操作简便，得到的重组球孢白僵菌非常稳定，外源毒力因子可持续表达。