一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

背景技术：

1、神经酸(c24h46o2)是一种超长链单不饱和脂肪酸，根据不饱和键的位置和碳链长度，命名为顺式15-二十四烯酸或ω-9二十四烯酸。神经酸是神经纤维以及神经细胞的核心成分，同时也是大脑生长和发育所必需的脂肪酸。神经酸最早在哺乳动物鲨鱼大脑中分离出来，因此也被称为鲨鱼油酸或鲨胆油酸。鲨鱼的大脑在受到严重损伤后，可以在短时间内自我修复，也是因为神经酸对受损脑组织中，神经纤维的修复和再生具有促进作用。神经酸具有的高价值的生物功能，使其在药理和营养方面的应用中发挥重要作用。

2、神经酸通过从动植物组织中提取或者化学合成法获得，动物来源的神经酸主要来自海洋生物。由于神经酸的市场价值和商业价值，在过去很长一段时间，发达国家是通过捕杀大量的鲨鱼来获取神经酸。出于对鲨鱼的保护禁止捕捞，神经酸资源出现短缺。利用化学合成法，以顺-13-十二烷基甲酯为前体合成神经酸，结果神经酸产率低，而且副产物多。因此，商业上的神经酸大部分来源于植物。研究表明一些野生植物的种子油中存在神经酸，但由于受生长周期、生存环境和数量的限制，使天然植物来源的神经酸的提取受限。

3、随着基因工程的发展，实现通过工程化改造植物、微藻和微生物来生产神经酸，使神经酸的大规模生产成为潜在可能。相比于酿酒酵母，解脂耶氏酵母作为一种产油酵母，能够高水平生产脂肪和油脂，并合成脂肪酸，可以为神经酸提供充足的脂肪酸前体，具有广泛利用底物的能力，是公认的安全性菌株，是神经酸合成的优势基因工程菌。

4、目前，一般通过外源引入神经酸合成途径相关基因来进行工程化改造，但神经酸的合成途径非常复杂、涉及众多相关基因，且不同物种来源的神经酸合成途径相关基因配合不同的底盘菌生产神经酸的效果也不同。如前所述，神经酸广泛存在于各种动、植物和微生物中，因此，目前亟需在现有海量的不同物种来源的神经酸合成途径相关基因中筛选到适合解脂耶氏酵母提高神经酸生产水平的基因。

技术实现思路

1、为解决现有技术中利用解脂耶氏酵母生产神经酸的产量不高的问题，本发明构建了能够表达脂肪酸延长酶基因atkcs、crakcs、maelo3和cgkcs的解脂耶氏酵母，使其有效产超长链脂肪酸(vlcfas)。

2、在此基础上，过表达了两拷贝的延长酶基因(cgkcs)及去饱和酶基因(mad15d)的融合表达形式cgkcs-l-mad15d、δ9去饱和酶(ole1)和二酰基甘油转移酶基因(dga1)的融合表达形式ole1-l-dga1和二酰基甘油转移酶基因(dga1)基因，成功获得了产神经酸的解脂耶氏酵母生产菌株。

3、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)的基因工程菌，所述基因工程菌为在解脂耶氏酵母po1f中敲除基因pex10，并表达来源于高山被孢霉菌(mortierella alpine)的c16/18延长酶基因maelo3、来源于拟南芥(arabidopsis thaliana)的延长酶基因atkcs和来源于海甘蓝(crambeabyssinica)的延长酶基因crakcs的菌株，所述基因工程菌还表达来源于碎米荠属(cardamine graeca)的延长酶基因cgkcs。

4、本发明所述解脂耶氏酵母po1f为现有已知基因改造酵母，其基因型为mata，leu2-270，ura3-302，xpr2-322，axp-2；表型为leu-，ura-，daep，daxp，suc+。

5、本发明所述基因pex10为解脂耶氏酵母po1f中与β氧化相关的基因。

6、如技术方案之一所述的基因工程菌，所述基因工程菌含有1个拷贝的延长酶基因cgkcs；或，所述基因工程菌含有1个拷贝的延长酶基因cgkcs和2个拷贝的所述延长酶基因cgkcs和来源于高山被孢霉菌的去饱和酶基因mad15d的融合基因cgkcs-l-mad15d。

7、在本发明的具体实施方案中，所述融合基因cgkcs-l-mad15d为通过neb连接酶将linker插入到所述延长酶基因cgkcs和所述去饱和酶基因mad15d中，使其使用同一套启动子和终止子，所述linker为本领域常规。

8、融合酶可以减少合成途径中中间物的积累，本发明将延长酶cgkcs和去饱和酶mad15d融合来促进神经酸的产生，以减少其他超长链脂肪酸的生成。虽然本发明将所述延长酶基因cgkcs和所述去饱和酶基因mad15d进行融合，但本领域技术人员能够合理预期，即便将这两个基因拆开，分别转入菌株的基因组单独表达，也能提升菌株产神经酸的产量。

9、如技术方案之一所述的基因工程菌，所述基因工程菌还过表达其自身的二酰基甘油转移酶基因dga1。

10、在本发明的优选实施方案中，所述基因工程菌共含有2个拷贝的所述二酰基甘油转移酶基因dga1。即菌株本身含有1个拷贝dga1，再额外转入1个拷贝dga1。

11、如技术方案之一所述的基因工程菌，所述基因工程菌共含有2个拷贝其自身的二酰基甘油转移酶基因dga1，还含有1个拷贝的所述二酰基甘油转移酶基因dga1和其自身的δ9去饱和酶基因ole1的融合基因ole1-l-dga1。即菌株本身含有1个拷贝dga1，再额外转入1个拷贝dga1和1个拷贝融合基因ole1-l-dga1。

12、二酰基甘油转移酶dga1可以促进c22:0、c24:0脂肪酸积累，δ9去饱和酶ole1有利于c24:1的形成，经过发明人多次实验，多拷贝一个dga1和一个ole1-l-dga1是最有利于神经酸(c24:1)生产的。

13、在本发明的具体实施方案中，融合基因ole1-l-dga1为通过neb连接酶将linker插入到所述二酰基甘油转移酶基因dga1和所述δ9去饱和酶基因ole1中，使其使用同一套启动子和终止子，所述linker为本领域常规。

14、融合酶可以减少合成途径中中间物的积累，本发明将二酰基甘油转移酶dga1和δ9去饱和酶ole1融合来促进神经酸的产生，以减少其他超长链脂肪酸的生成。虽然本发明将所述二酰基甘油转移酶基因dga1和所述δ9去饱和酶基因ole1进行融合，但本领域技术人员能够合理预期，即便将这两个基因拆开，分别转入菌株的基因组单独表达，也能提升菌株产神经酸的产量。

15、如技术方案之一所述的基因工程菌，所述c16/18延长酶基因maelo3的核苷酸序列如seq id no:37所示；和/或，所述延长酶基因atkcs的核苷酸序列如seq id no:34所示；和/或，所述延长酶基因crakcs的核苷酸序列如seq id no:35所示；和/或，所述延长酶基因cgkcs的核苷酸序列如seq id no:33或seq id no:36所示；和/或，所述二酰基甘油转移酶基因dga1的核苷酸序列如seq id no:38所示；和/或，所述融合基因cgkcs-l-mad15d的核苷酸序列如seq id no:39所示；和/或，所述融合基因ole1-l-dga1的核苷酸序列如seq idno:40所示。

16、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种如技术方案之一所述的基因工程菌的构建方法，所述构建方法包含将待表达基因整合至解脂耶氏酵母的基因组中，所述整合的方法为在解脂耶氏酵母中转入包含待表达基因的整合表达质粒；和/或，所述构建方法基于crispr/cas9操作系统。

17、如技术方案之二所述的构建方法，当所述构建方法基于crispr/cas9操作系统时，包含如下步骤：

18、(1)构建含有donor质粒和sgrna质粒的质粒对，所述donor质粒含有待表达基因，所述sgrna质粒含有靶向基因组上待整合位点的sgrna序列。

19、(2)将所述质粒对同时转化到解脂耶氏酵母中，筛选获得目的菌株。

20、如技术方案之二所述的构建方法，所述donor质粒或所述整合表达质粒中的待表达基因的启动子为uas4b+tef；和/或，所述donor质粒的骨架为phr_hrgfp；和/或，所述sgrna质粒的骨架为pcrispryl；和/或，所述整合表达质粒的骨架为pina1269或p3204。

21、在本发明的优选实施方案中，所述donor质粒为包含所述延长酶基因cgkcs或所述融合基因cgkcs-l-mad15d的phr_hrgfp质粒，所述整合表达质粒为包含所述二酰基甘油转移酶基因dga1的pina1269质粒或包含所述融合基因ole1-l-dga1的p3204质粒。

22、在本发明中，所述启动子uas4b+tef为由来源于质粒pina1312的启动子hp4d中的增强子部分uas4b和来源于解脂耶氏酵母菌polf中dna的强启动子tef组成的启动子，其具体构建方法参见专利cn 107815425 a。

23、在本发明中，所述phr_hrgfp指代的是包含质粒phr_a3_hrgfp、phr_f1-3_hrgfp、phr_axp_hrgfp、phr_f1_hrgfp、phr_a1-2_hrgfp和phr_e1-3_hrgfp在内的质粒的统称；所述pcrispryl指代的是包含质粒pcrispryl_a3、pcrispryl_f1-3、pcrispryl_axp、pcrispryl_f1、pcrispryl_a1-2和pcrispryl_e1-3在内的质粒的统称；其中，a3、f1-3、axp、f1、a1-2和e1-3分别对应于解脂耶氏酵母基因组中特定的基因位点。

24、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种生产神经酸的方法，所述方法包括在培养基中发酵如技术方案之一所述的基因工程菌，并从中分离得到神经酸；所述培养基优选ypd培养基。

25、在本发明的较佳实施方案中，所述培养基中还额外添加油脂或油酸；所述油脂优选菜籽油。

26、在本发明的更佳实施方案中，所述菜籽油添加的体积百分比为1％。

27、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：如技术方案之一所述的基因工程菌在生产神经酸中的应用。

28、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

29、本发明的积极进步效果在于：本发明的产神经酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果为(1)神经酸的产量高：本发明的产神经酸的解脂耶氏酵母基因工程菌na06构建方法简便，通过发酵可以高产神经酸，能使神经酸在50ml摇瓶中达到111.6mg/l的产量，具有良好的应用前景。(2)通过对其合成前体的加入，在添加1％的菜籽油时，本发明的产神经酸的解脂耶氏酵母基因工程菌na06能使神经酸在50ml摇瓶中达到185.1mg/l的产量。(3)其构建方法简便，通过crispr/cas9及整合型质粒回补筛选标记的方式仅仅导入4个基因(cgkcs、cgkcs-l-mad15d、dga1、dga1-l-ole1)，获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够应用于大规模的商业化生产，前景良好。