一种由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系及其制备方法

1.本发明涉及高分子材料技术领域和干细胞生物学技术领域，特别涉及一种由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系及其制备方法，具体是利用不同多臂苯甲醛修饰的聚乙二醇(multi-arm-pegda)与己二酸二酰肼修饰的明胶(gtnadh)高分子链通过动态亚胺键和酰腙键交联形成一系列具有不同细胞介导降解性的水凝胶。


背景技术：

2.高分子水凝胶(hydrogel)是一类含水率高、生物相容性好且具有模拟细胞外基质三维网孔结构的仿生高分子材料，在细胞三维支架及组织工程等再生医学领域有着广泛的应用。在体外三维干细胞培养中，干细胞分泌的基质金属蛋白酶可对水凝胶网络结构进行有效重塑和降解，使细胞能够进一步形态发生、迁移、增殖或增强细胞间连接，而水凝胶本身具有响应基质金属蛋白酶的不同降解性设计，则可有效调节干细胞行为，包括干性维持、增殖、分化和迁移等。
3.申请号为202110477460.3的专利申请公开了可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法，这个水凝胶用于破损肺组织修补，但是不能通过细胞介导独立可控来降解。目前水凝胶材料的降解主要受到两个因素的调控，一个是用于交联的化学键的裂解速率，一个是其网络结构。调节高分子浓度或交联化学键可有效改变其降解性。然而，高分子成份、浓度或交联方式的改变也将引起水凝胶其他性能，如网孔大小、交联密度、生物活性位点含量及力学强度的变化，因此其降解性很难独立调控。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系及其制备方法，首先通过苯甲醛(da)与不同多臂聚乙二醇的缩醛化反应，合成水溶性的多臂苯甲醛化聚乙二醇(multi-arm-pegda)，同时将己二酸二酰肼(adh)修饰到明胶高分子链上，得到己二酸二酰肼化明胶(gtnadh)，最后将多臂苯甲醛化聚乙二醇与不同酰肼取代度的己二酸二酰肼化明胶，在生理条件下发生席夫碱反应，生成动态酰腙键和亚胺键，得到不同交联结构的一系列明胶-多臂聚乙二醇水凝胶；由于明胶高分子链上本身具有的细胞降解位点及聚乙二醇的不同多臂结构赋予该水凝胶体系细胞介导的可控降解性，此外，酰腙键与亚胺键的动态可逆特性，使水凝胶具有优异的自愈合及可注射性。
5.为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系，由等体积的不同多臂苯甲醛化聚乙二醇溶液与己二酸二酰肼化明胶溶液组成；
7.所述的苯甲醛化聚乙二醇溶液和己二酸二酰肼化明胶溶液，两者的质量分数均为1％～20％，溶剂均为pbs溶液；
8.所述的苯甲醛化聚乙二醇包括：多臂的聚乙二醇、4-甲酰基苯甲酸p-cba、4-二甲氨基吡啶dmap、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐edc
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hcl，控制多臂聚乙二醇的羟基、4-甲酰基苯甲酸的羧基、edc
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hcl、dmap的摩尔比为1：2：2：0.5；
9.所述的多臂的聚乙二醇选自：2-arm-peg、3-arm-peg、4-arm-peg、5-arm-peg、6-arm-peg、7-arm-peg、8-arm-peg、9-arm-peg、10-arm-peg；
10.所述的己二酸二酰肼化明胶，包括明胶、己二酸二酰肼(adh)，1-羟基苯并三唑水合物hobt、n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐edc
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hcl，该反应体系中，明胶按1g计，其余adh、hobt、edc
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hcl的摩尔比为1：0.5～2：0.4～0.8。
11.一种由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系的制备方法，包括以下步骤：
12.步骤一:在500ml的圆形烧瓶中加入100-250ml的二氯甲烷，在氮气的保护下，依次加入分子量介于500～20000da之间的多臂的聚乙二醇、4-甲酰基苯甲酸p-cba、4-二甲氨基吡啶dmap、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐edc
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hcl，控制多臂聚乙二醇的羟基、4-甲酰基苯甲酸的羧基、edc
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hcl、dmap的摩尔比为1：2：2：0.5，室温下反应18-36h；反应结束后取下反应瓶将溶液用饱和食盐水萃取2-5次，用无水硫酸镁干燥再用旋蒸仪浓缩；然后将上层液体在过量冰乙醚中沉淀，重复2-5次；所得产品用蒸馏水透析，每天更换一次水，透析一周，最终用冷冻干燥机冻干，得到不同多臂化苯甲醛聚乙二醇；
13.所述的多臂的聚乙二醇选自：2-arm-peg、3-arm-peg、4-arm-peg、5-arm-peg、6-arm-peg、7-arm-peg、8-arm-peg、9-arm-peg、10-arm-peg；
14.步骤二：在250ml的圆形烧瓶中加入40-160mlph5.2～5.5的pbs，再加入1g的a型猪皮明胶，在50-60℃加热条件下，磁旋转搅拌1-1.5h，使其充分溶解；再加入己二酸二酰肼(adh)，并搅拌均匀；将溶解在二甲基亚砜(dmso)中的1-羟基苯并三唑水合物(hobt)加入反应瓶中并搅拌均匀；最后加入n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐edc
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hcl，该反应体系中，adh、hobt、edc
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hcl的摩尔比为1：0.5～2：0.4～0.8，最终得到20-80％取代度的己二酸二酰肼化明胶；同时用氢氧化钠naoh溶液将ph调节至5.0～5.3；将混合物在50-60℃下搅拌24-36h，反应后用蒸馏水透析，每天更换一次水，透析一周，随后冻干，得到己二酸二酰肼化明胶；
15.步骤三：将步骤一产物不同多臂的苯甲醛化聚乙二醇分别溶解在pbs溶液中，质量分数为1％～20％；带有氨基和肼基的步骤二产物己二酸二酰肼化明胶溶解在pbs溶液中，质量分数为1％～20％，然后取等体积的不同多臂苯甲醛化聚乙二醇溶液分别与己二酸二酰肼化明胶溶液在37℃下涡旋震荡均匀，静置得到不同降解性的水凝胶体系。
16.本发明的有益效果：
17.1、采用己二酸二酰肼化明胶上的氨基和肼基和多臂苯甲醛化聚乙二醇上的醛基反应，通过生成的可逆亚胺键和酰腙键交联制备得到细胞介导降解性独立可控的水凝胶体系。其中己二酸二酰肼化明胶大分子上的氨基、酰肼可与多臂苯甲醛化聚乙二醇上的醛基通过席夫碱反应分别生成动态亚胺键和酰腙键，这两种动态共价键均具有动态可逆的反应特征。本发明选择不同多臂苯甲醛化聚乙二醇与己二酸二酰肼化明胶合成得到不同交联网格结构水凝胶，利用明胶的细胞降解性及聚乙二醇不同多臂网格结构共同赋予该水凝胶体系独立可控的细胞降解性。
18.2、本发明合成过程简单绿色，反应条件温和，得到的水凝胶在组织工程、细胞三维培养、干细胞移植、药物缓释等生物医学领域具有良好的应用前景。由于明胶高分子链上本身具有的细胞降解位点及聚乙二醇的不同多臂结构赋予该水凝胶体系细胞介导的可控降解性，同时不同取代度可以调控水凝胶的力学性质。此外，酰腙键与亚胺键的动态可逆特性使水凝胶具有优异的自愈合及可注射性。细胞分泌的基质金属蛋白酶可打断和降解明胶高分子链，而具有不同多臂结构的聚乙二醇赋予了该水凝胶体系不同的降解速率，即可通过调节聚乙二醇不同多臂网格结构独立调控水凝胶细胞降解性，同时可保持其成胶成份、高分子浓度及力学性能等其他参数统一不变。此外，动态亚胺键和酰腙键的可逆交联方式还将赋予该水凝胶体系优良的自愈合性能和可注射性。该水凝胶体系可广泛应用于体外不同干细胞的三维培养、扩增及分化，并可用于干细胞移植治疗。
附图说明
19.图1为细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系(2、4、8臂)示意图。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明作更详细的说明。
21.实施例一
22.本实施例，包括以下步骤：
23.步骤一:准备9个500ml的圆形烧瓶，都加入50ml的二氯甲烷，在氮气的保护下，分别加入1g二臂的聚乙二醇(2-arm-peg)(分子量为5000da)、1g三臂的聚乙二醇(3-arm-peg)(分子量为7500da)、1g四臂的聚乙二醇(4-arm-peg)(分子量为10000da)、1g五臂的聚乙二醇(5-arm-peg)(分子量为12500da)、1g六臂的聚乙二醇(6-arm-peg)(分子量为15000da)、1g七臂的聚乙二醇(7-arm-peg)(分子量为17500da)、1g八臂的聚乙二醇(8-arm-peg)(分子量为20000da)、1g九臂的聚乙二醇(9-arm-peg)(分子量为22500da)、1g十臂的聚乙二醇(10-arm-peg)(分子量为25000da)搅拌混匀后加入0.1201g4-甲酰基苯甲酸(p-cba)，0.0244g4-二甲氨基吡啶(dmap)、0.1534g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc
.
hcl)，室温下反应24h；反应结束后取下反应瓶将溶液用大约100ml饱和食盐水萃取3次，用无水硫酸镁干燥，再用旋蒸仪进行浓缩；然后在上层液体中加入100ml预冷的乙醚中沉淀，重复3次，所得产物用蒸馏水透析，其中2、3-arm-peg用5kda透析袋，4、5-arm-peg用10kda透析袋，6、7-arm-peg用15kda透析袋，8、9、10-arm-peg用20kda透析袋，每天更换一次水，透析约一周，最终用冷冻干燥机冻干，可得到二、三、四、五、六、七、八、九、十臂的苯甲醛聚乙二醇。
24.步骤二：在250ml的圆形烧瓶中加入40mlph5.5的pbs，加入1.0克a型猪皮明胶，在50℃加热下，磁旋转搅拌大约1小时使其充分溶解；再加入1.392g己二酸二酰肼，并搅拌均匀；再将溶解在5mldmso中的0.308g1-羟基苯并三唑水合物(hobt)加入反应瓶中并搅拌均匀；最后加入0.308gn-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐((edc
.
hcl))。同时快速使用1mnaoh将ph调节至5.0-5.3；将混合物在50℃下搅拌24h。反应后用蒸馏水透析(8kda透析袋)，每天更换一次水，透析约一周，随后冻干，得到取代度约在38％的己二酸二酰肼明
胶。
25.步骤三：根据干细胞的来源，选择合适浓度的前体物质进行溶解，如将步骤一产物带有醛基的二、三、四、五、六、七、八、九、十臂的苯甲醛聚乙二醇(2-arm-pegda、3-arm-pegda、4-arm-pegda、5-arm-pegda、6-arm-pegda、7-arm-pegda、8-arm-pegda、9-arm-pegda、10-arm-pegda)按照质量分数2％溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到前体溶液分别为2％2-arm-pegda、2％3-arm-pegda、2％4-arm-pegda、2％5-arm-pegda、2％6-arm-pegda、2％7-arm-pegda、2％8-arm-pegda、2％9-arm-pegda、2％10-arm-pegda；步骤二产物带有氨基和肼基的己二酸二酰肼明胶按照质量分数10％溶解在磷酸盐缓冲溶液中，充分涡旋混匀后，得到前体溶液为10％gtnadh；取等体积如100μl的二、三、四、五、六、七、八、九、十臂苯甲醛聚乙二醇溶液与等体积如100μl的己二酸二酰肼明胶溶液，37℃下将其震荡均匀，同样在37℃下静置得到由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系水凝胶，即1％2-arm-pegda/5％gtnadh、1％3-arm-pegda/5％gtnadh、1％4-arm-pegda/5％gtnadh、1％5-arm-pegda/5％gtnadh、1％6-arm-pegda/5％gtnadh、1％7-arm-pegda/5％gtnadh、1％8-arm-pegda/5％gtnadh、1％9-arm-pegda/5％gtnadh、1％10-arm-pegda/5％gtnadh。
26.通过将二、三、四、五、六、七、八、九、十臂聚乙二醇的水凝胶溶液注入模具中，成胶后取出测量水凝胶的模量和降解性，可以发现它们的模量一致。同时用基质金属蛋白酶溶液测量降解性，可以发现随着水凝胶体系中聚乙二醇臂的增大，降解性越慢，证实该种水凝胶具有相同的刚度而降解性不同。
27.参照图1，由于明胶高分子链上本身具有的细胞降解位点及聚乙二醇的不同多臂结构赋予该水凝胶体系细胞介导的可控降解性。
28.实施例二：
29.本实施例，包括以下步骤：
30.步骤一:准备9个500ml的圆形烧瓶，都加入50ml的二氯甲烷，在氮气的保护下，分别加入1g二臂的聚乙二醇(2-arm-peg)(分子量为5000da)、1g三臂的聚乙二醇(3-arm-peg)(分子量为7500da)、1g四臂的聚乙二醇(4-arm-peg)(分子量为10000da)、1g五臂的聚乙二醇(5-arm-peg)(分子量为12500da)、1g六臂的聚乙二醇(6-arm-peg)(分子量为15000da)、1g七臂的聚乙二醇(7-arm-peg)(分子量为17500da)、1g八臂的聚乙二醇(8-arm-peg)(分子量为20000da)、1g九臂的聚乙二醇(9-arm-peg)(分子量为22500da)、1g十臂的聚乙二醇(10-arm-peg)(分子量为25000da)搅拌混匀后加入0.1201g4-甲酰基苯甲酸(p-cba)，0.0244g4-二甲氨基吡啶(dmap)、0.1534g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc
.
hcl)，室温下反应36h；反应结束后取下反应瓶将溶液用大约100ml饱和食盐水萃取4次，用无水硫酸镁干燥，再用旋蒸仪进行浓缩；然后在上层液体中加入100ml预冷的乙醚中沉淀，重复4次，所得产物用蒸馏水透析，其中2、3-arm-peg用5kda透析袋，4、5-arm-peg用10kda透析袋，6、7-arm-peg用15kda透析袋，8、9、10-arm-peg用20kda透析袋，每天更换一次水，透析约一周，最终用冷冻干燥机冻干，可得到二、三、四、五、六、七、八、九、十臂的苯甲醛聚乙二醇。
31.步骤二：在250ml的圆形烧瓶中加入40mlph5.5的pbs，加入1.0克a型猪皮明胶，在50℃加热下，磁旋转搅拌大约1小时使其充分溶解；再加入1.74g己二酸二酰肼，并搅拌均匀；再将溶解在5mldmso中的0.77g1-羟基苯并三唑水合物(hobt)加入反应瓶中并搅拌均
匀；最后加入0.77gn-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐((edc
.
hcl))。同时快速使用1mnaoh将ph调节至5.0-5.3；将混合物在55℃下搅拌36h。反应后用蒸馏水透析(8kda透析袋)，每天更换一次水，透析约一周，随后冻干，得到取代度约在56％的己二酸二酰肼明胶。
32.步骤三：根据干细胞的来源，选择合适浓度的前体物质进行溶解，如将步骤一产物带有醛基的二、三、四、五、六、七、八、九、十臂的苯甲醛聚乙二醇(2-arm-pegda、3-arm-pegda、4-arm-pegda、5-arm-pegda、6-arm-pegda、7-arm-pegda、8-arm-pegda、9-arm-pegda、10-arm-pegda)按照质量分数3％溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到前体溶液分别为3％2-arm-pegda、3％3-arm-pegda、3％4-arm-pegda、3％5-arm-pegda、3％6-arm-pegda、3％7-arm-pegda、3％8-arm-pegda、3％9-arm-pegda、3％10-arm-pegda；步骤二产物带有氨基和肼基的己二酸二酰肼明胶按照质量分数12％溶解在磷酸盐缓冲溶液中，充分涡旋混匀后，得到前体溶液为12％gtnadh；取等体积如100μl的二、三、四、五、六、七、八、九、十臂苯甲醛聚乙二醇溶液与等体积如100μl的己二酸二酰肼明胶溶液，37℃下将其震荡均匀，同样在37℃下静置得到由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系水凝胶，即1.5％2-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％3-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％4-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％5-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％6-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％7-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％8-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％9-arm-pegda/6％gtnadh、1.5％10-arm-pegda/6％gtnadh。
33.通过将二、三、四、五、六、七、八、九、十臂聚乙二醇的水凝胶溶液注入模具中，成胶后取出测量水凝胶的模量和降解性，可以发现它们的模量一致。同时用基质金属蛋白酶溶液测量降解性，可以发现随着水凝胶体系中聚乙二醇臂的增大，降解性越慢，证实该种水凝胶具有相同的刚度而降解性不同。
34.实施例三：
35.本实施例，包括以下步骤：
36.步骤一:准备9个500ml的圆形烧瓶，都加入50ml的二氯甲烷，在氮气的保护下，分别加入1g二臂的聚乙二醇(2-arm-peg)(分子量为5000da)、1g三臂的聚乙二醇(3-arm-peg)(分子量为7500da)、1g四臂的聚乙二醇(4-arm-peg)(分子量为10000da)、1g五臂的聚乙二醇(5-arm-peg)(分子量为12500da)、1g六臂的聚乙二醇(6-arm-peg)(分子量为15000da)、1g七臂的聚乙二醇(7-arm-peg)(分子量为17500da)、1g八臂的聚乙二醇(8-arm-peg)(分子量为20000da)、1g九臂的聚乙二醇(9-arm-peg)(分子量为22500da)、1g十臂的聚乙二醇(10-arm-peg)(分子量为25000da)搅拌混匀后加入0.1201g4-甲酰基苯甲酸(p-cba)，0.0244g4-二甲氨基吡啶(dmap)、0.1534g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc
.
hcl)，室温下反应18h；反应结束后取下反应瓶将溶液用大约100ml饱和食盐水萃取5次，用无水硫酸镁干燥，再用旋蒸仪进行浓缩；然后在上层液体中加入100ml预冷的乙醚中沉淀，重复5次，所得产物用蒸馏水透析，其中2、3-arm-peg用5kda透析袋，4、5-arm-peg用10kda透析袋，6、7-arm-peg用15kda透析袋，8、9、10-arm-peg用20kda透析袋，每天更换一次水，透析约一周，最终用冷冻干燥机冻干，可得到二、三、四、五、六、七、八、九、十臂的苯甲醛聚乙二醇。
37.步骤二：在250ml的圆形烧瓶中加入40mlph5.5的pbs，加入1.0克a型猪皮明胶，在
50℃加热下，磁旋转搅拌大约1小时使其充分溶解；再加入3.915g己二酸二酰肼，并搅拌均匀；再将溶解在5mldmso中的1.8943g1-羟基苯并三唑水合物(hobt)加入反应瓶中并搅拌均匀；最后加入1.7325gn-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐((edc
.
hcl))。同时快速使用1mnaoh将ph调节至5.0-5.3；将混合物在60℃下搅拌30h。反应后用蒸馏水透析(8kda透析袋)，每天更换一次水，透析约一周，随后冻干，得到取代度约在75％的己二酸二酰肼明胶。
38.步骤三：根据干细胞的来源，选择合适浓度的前体物质进行溶解，如将步骤一产物带有醛基的二、三、四、五、六、七、八、九、十臂的苯甲醛聚乙二醇(2-arm-pegda、3-arm-pegda、4-arm-pegda、5-arm-pegda、6-arm-pegda、7-arm-pegda、8-arm-pegda、9-arm-pegda、10-arm-pegda)按照质量分数4％溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到前体溶液分别为4％2-arm-pegda、4％3-arm-pegda、4％4-arm-pegda、4％5-arm-pegda、4％6-arm-pegda、4％7-arm-pegda、4％8-arm-pegda、4％9-arm-pegda、4％10-arm-pegda；步骤二产物带有氨基和肼基的己二酸二酰肼明胶按照质量分数8％溶解在磷酸盐缓冲溶液中，充分涡旋混匀后，得到前体溶液为8％gtnadh；取等体积如100μl的二、三、四、五、六、七、八、九、十臂苯甲醛聚乙二醇溶液与等体积如100μl的己二酸二酰肼明胶溶液，37℃下将其震荡均匀，同样在37℃下静置得到由细胞介导降解性独立可控的明胶-多臂聚乙二醇水凝胶体系水凝胶，即2％2-arm-pegda/4％gtnadh、2％3-arm-pegda/4％gtnadh、2％4-arm-pegda/4％gtnadh、2％5-arm-pegda/4％gtnadh、2％6-arm-pegda/4％gtnadh、2％7-arm-pegda/4％gtnadh、2％8-arm-pegda/4％gtnadh、2％9-arm-pegda/4％gtnadh、2％10-arm-pegda/4％gtnadh。
39.通过将二、三、四、五、六、七、八、九、十臂聚乙二醇的水凝胶溶液注入模具中，成胶后取出测量水凝胶的模量和降解性，可以发现它们的模量一致，且随着臂的增大，降解性越慢，证实该种水凝胶具有相同的刚度而降解性不同。