核酸序列测定方法与流程

本发明涉及一种核酸序列测定方法。

背景技术：

1、作为测定样品中含有的具有特定核酸序列的靶标的方法，众所周知的是使用dna微阵列(具有特定核酸序列的互补序列的检测探针设置于基板等的固相面)的方法。该方法是如下方法：利用添加于dna微阵列的样品中含有的靶标通过杂交反应被dna微阵列的检测探针捕集的性质来测定靶标。在该方法中，除了能够测定样品中是否包含靶标，还能够测定样品中含有的靶标的量。在专利文献1中，公开了使用dna微阵列来测定靶标的测定方法。

2、为了将靶标提供给dna微阵列，需要提取成为靶标的核酸。在靶标是细菌等微生物中含有的核酸的情况下，已知通过酶处理或化学处理来熔解微生物的细胞膜等的方法，或者通过基于弗氏压碎器或珠磨器等产生的物理刺激的破碎等来提取核酸的方法。此外，在专利文献2中公开了如下方法：不使用酶处理或化学处理、物理处理，而使用密闭的容器，通过在高温下加热来提取核酸。

3、现有技术文献

4、专利文献1：日本专利公开公报特开2015-43702号

5、专利文献2：日本专利公开公报特开2012-157265号

6、然而，也考虑到如果能够不进行任何处理而直接通过上述专利文献1的核酸序列测定方法来测定含有所提取的靶标(rna)的样品，则能够大幅削减靶标的测定所需的工夫和时间。但是，如果将含有靶标的样品直接应用于上述专利文献1的核酸序列测定方法，则在杂交反应时，存在样品中含有的蛋白质等夹杂物产生影响从而使测定精度恶化的问题。此外，有时样品溶液出现白色混浊而不能检测到从dna微阵列发出的荧光。此外，在荧光测量时，作为所述夹杂物的蛋白质(以下也称为夹杂蛋白质)被激发光激发而呈现荧光，因此存在使背景光上升的问题。

技术实现思路

1、鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种核酸序列测定方法，该核酸序列测定方法能够削减测定所需的工夫和时间，并且能够高精度地测定样品溶液中含有的具有特定序列的rna。

2、为了达成上述目的，本发明采用以下结构。

3、[1]一种核酸序列测定方法，通过杂交来测定细胞悬浮液中含有的具有特定核酸序列的目标rna，所述核酸序列测定方法包括：将所述细胞悬浮液以加压状态在100～200℃下加热，得到rna提取液的工序；向所述rna提取液中添加蛋白质分解酶来进行反应，制备样品溶液的工序；将所述样品溶液供给到包括与所述目标rna杂交的荧光探针的核酸序列测定用器件的工序；使所述目标rna与所述荧光探针进行杂交反应的工序；以及测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光的工序。

4、[2]根据[1]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在测量所述荧光的工序中，在不清洗供给到所述核酸序列测定用器件的样品溶液的状态下，测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光。

5、[3]根据[1]或[2]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在得到所述rna提取液的工序中，在密闭的容器中加热所述细胞悬浮液。

6、[4]根据[1]～[3]中任意一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述蛋白质分解酶是蛋白酶k。

7、[5]根据[1]～[4]中任意一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述核酸序列测定用器件包括：荧光探针，具有结合部和基端，并且荧光分子附加在顶端或中途的位置；消光探针，具有结合部和基端，并且在与所述荧光探针结合时，消光分子附加在接近所述荧光探针的荧光分子的位置；以及基板，具有分别固定所述荧光探针的基端和所述消光探针的基端的固相面，所述荧光探针的结合部和所述消光探针的结合部具有相互互补的序列，所述荧光探针和所述消光探针的至少一方具有检测部，所述检测部具有与所述目标rna的核酸序列互补的序列，在未发生所述目标rna与所述检测部的杂交的情况下，通过维持所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合，通过接近所述荧光分子的所述消光分子，所述荧光分子所呈现的荧光被消光，在发生了所述目标rna与所述检测部的杂交的情况下，通过所述荧光探针的结合部与所述消光探针的结合部的结合被解除，以从所述消光分子分离的所述荧光分子成为呈现荧光的位置关系的方式，所述荧光探针和所述消光探针各自的基端固定于固相面。

8、根据本发明的核酸序列测定方法，具有如下效果：能够削减测定所需的工夫和时间，并且能够高精度地测定样品溶液中含有的具有特定序列的rna。

技术特征：

1.一种核酸序列测定方法，通过杂交来测定细胞悬浮液中含有的具有特定核酸序列的目标rna，所述核酸序列测定方法的特征在于包括：

2.根据权利要求1所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在测量所述荧光的工序中，在不清洗供给到所述核酸序列测定用器件的样品溶液的状态下，测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光。

3.根据权利要求1或2所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在得到所述rna提取液的工序中，在密闭的容器中加热所述细胞悬浮液。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述蛋白质分解酶是蛋白酶k。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，

技术总结
本发明提供一种核酸序列测定方法，通过杂交来测定细胞悬浮液中含有的具有特定核酸序列的目标RNA，所述核酸序列测定方法包括：将细胞悬浮液以加压状态在100～200℃下加热，得到RNA提取液的工序；向所述RNA提取液中添加蛋白质分解酶来进行反应，制备样品溶液的工序；将所述样品溶液供给到包括与所述目标RNA杂交的荧光探针的核酸序列测定用器件的工序；使所述目标RNA与所述荧光探针进行杂交反应的工序；以及测量来自所述核酸序列测定用器件的荧光的工序。

技术研发人员：蓼沼崇,宫内祐树,田口朋之
受保护的技术使用者：横河电机株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15