聚合物含量降低的洗涤剂组合物的制作方法

本发明涉及具有改善的可持续性的洗涤剂组合物，其中通过使用具有纤维素酶活性的多肽，任选地与dna酶组合来降低聚合物的水平。

背景技术：

1、洗涤剂释放污物和保持污物悬浮的能力对其效率至关重要。未被洗涤剂悬浮的颗粒污垢将再沉积在织物上。已知再沉积的污垢通常比原始污垢更难去除，部分原因是其粒径更小。洗涤剂中的表面活性剂释放污物和使其保持悬浮的能力通常不足，因此将聚合物添加至洗涤剂中。聚合物的添加有助于防止服装灰化、暗淡和黄化，从消费者角度来说，这些显然是所关心的。

2、然而，聚合物通常源自石油化学资源，并且由于环境问题而面临审查，最重要的是因为它们来自不可再生来源并且难以生物降解或甚至一直存在于环境中，因此是不可持续的。期望提供具有改善的可持续性特征的替代品，同时保持与其他洗涤剂成分的相容性。此外，必须保持消费者利益和性能效果。

技术实现思路

1、存在于洗涤剂中的石油化学衍生聚合物不可持续，因为它们来自不可再生来源并且难以生物降解或甚至一直存在于环境中。本发明的发明人已经惊讶地发现，通过添加纤维素酶部分或甚至全部替代洗涤剂中的聚合物可以实现更可持续的洗涤剂组合物(即具有改善的可持续性特征的洗涤剂组合物)，同时保持该洗涤剂的洗涤性能。除了产生自可再生农业来源外，并且与聚合物相比，纤维素酶是环境中天然存在的并且易生物降解。

2、用纤维素酶替代聚合物符合联合国可持续发展目标，特别是目标12“负责任消费和生产”：用纤维素酶替代聚合物使洗涤剂生产商(以及因此最终用户)从化石原料转移至可再生原料，并且减少排放到环境中的持久性化学品的量。因此，本发明披露了纤维素酶如何可以部分或完全替代聚合物用于在洗涤周期内减少或去除污垢再沉积到物品上，从而改善洗涤剂的可持续性特征。

3、定义

4、细菌的：术语关于多肽(如酶，例如，纤维素酶)的“细菌的”是指由细菌基因组编码并且因此可直接从细菌基因组衍生的多肽，其中这种细菌未经过遗传修饰来编码所述多肽，例如，通过重组dna技术将编码序列引入基因组中。因此，在本发明的上下文中，术语“细菌纤维素酶”或“获得自细菌来源的具有纤维素酶活性的多肽”或“细菌来源的多肽”是指由细菌物种的基因组编码并且因此可直接从细菌物种的基因组衍生的纤维素酶，其中这些细菌物种未经受通过引入编码所述纤维素酶的重组dna进行的遗传修饰。因此，编码具有纤维素酶活性的细菌多肽的核苷酸序列是天然在细菌物种遗传背景中的序列。编码具有纤维素酶活性的细菌多肽的序列也可以称为野生型纤维素酶(或亲本纤维素酶)。具有纤维素酶活性的细菌多肽包括重组产生的野生型。在另一个方面，本发明提供了具有纤维素酶活性的多肽，其中所述多肽与细菌纤维素酶基本上同源。在本发明的上下文中，术语“基本上同源”表示具有纤维素酶活性的多肽与所选择的细菌纤维素酶的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少96％、97％、98％，以及最优选地至少99％的同一性。

5、纤维素酶：术语“纤维素酶”意指水解纤维素材料的一种或多种(例如，几种)酶。可互换使用两个术语：“具有纤维素酶活性的多肽”和“纤维素酶”。纤维素酶可以选自由以下组成的组：属于gh5、gh7、gh12、gh44、gh45、ec 3.2.1.4、ec 3.2.1.21、ec 3.2.1.91和ec3.2.1.172的纤维素酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶(例如，ec 3.2.1.4)、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。

6、适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的酶的单组分和混合物。也设想到了化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。纤维素酶可以例如是单组分内切-1,4-β-葡聚糖酶(又称为内切葡聚糖酶)、或单组分内切-1,4-β-葡聚糖酶的混合物。

7、适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属(pseudomonas)、腐质霉属(humicola)、毁丝霉属(myceliophthora)、镰孢属(fusarium)、梭孢壳属(thielavia)、木霉属(trichoderma)、和枝顶孢属(acremonium)的那些。示例性纤维素酶包括来自特异腐质霉(humicola insolens)(us 4,435,307)或来自木霉属(例如里氏木霉(t.reesei)或绿色木霉(t.viride))的真菌纤维素酶。其他适合的纤维素酶来自梭孢壳属，例如在wo 96/29397中描述的土生梭孢壳霉(thielavia terrestris)或在us 5,648,263、us 5,691,178、us 5,776,757、wo 89/09259、和wo 91/17244中披露的由嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)和尖孢镰孢(fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。如wo 02/099091和jp 2000210081中所述，来自芽孢杆菌属的纤维素酶也是相关的。适合的纤维素酶是具有护理益处的碱性或中性纤维素酶。纤维素酶的实例在ep 0 495 257、ep 0 531 372、wo 96/11262、wo 96/29397、wo 98/08940中描述。其他实例是如描述于wo 94/07998、ep 0 531315、us 5,457,046、us 5,686,593、us 5,763,254、wo 95/24471、wo 98/12307中的那些纤维素酶变体。

8、其他纤维素酶是具有如下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与wo 2002/099091的seq id no:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％同一性；或具有如下序列的家族44木葡聚糖酶，该序列与wo 2001/062903的seq id no:2的位置40-559具有至少60％同一性。

9、可商购的纤维素酶包括premium、classic、(诺维信公司(novozymes a/s))、puradax ha、和puradaxeg；revitalenz 1000；revitalenz 200；revitalenz 2000(杜邦工业生物科学公司(dupontindustrial biosciences))、kac-500(b)tm(花王株式会社(kao corporation))、biotouchdcl；biotouch flx1(ab酶公司(ab enzymes))。

10、用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在zhang等人,2006,biotechnology advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(iupac)建立的(ghose,1987,pure appl.chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。

11、色差(l值)：lab色彩空间是针对明度具有尺寸l的色彩对立空间。l值，l*代表在l*＝0下的最暗的黑色，并且为在l*＝100下的最亮的白色。在本发明的上下文中，l值还称为色差。

12、洗涤剂辅助剂成分：这些另外的辅助剂组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的操作的性质。适合的辅料包括但不限于以下描述的组分，如表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、s、s、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物软化剂、载体、水溶助剂、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、溶剂、和/或颜料。

13、洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(如纺织品)去除不希望的化合物的组合物。该洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品，用于家用清洁和工业清洁二者。这些术语涵盖选择用于希望的特定类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、条状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；织物清新剂；织物软化剂；洗衣增效剂；以及纺织品和衣物预去污剂/预处理)。除了含有本发明的酶之外，该洗涤剂配制品还可以含有一种或多种另外的酶(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物)，和/或洗涤剂辅助剂成分，如表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物(如本文所列)、织物柔顺剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂。

14、酶洗涤益处：术语“酶洗涤益处”在本文中定义为将酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的相同洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要洗涤益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污垢或可见污垢非常少、防止或减少在洗涤过程中所释放的污垢再沉积(也被称作抗再沉积的效果)、完全或部分地恢复纺织品的白度(也被称作变白的效果)，该纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。还包括维持白度，例如，防止灰化或暗沉。不直接与催化污渍去除或防止污垢再沉积相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是防止或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的球或绒毛(也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，使织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是另一种酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。

15、片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中该片段具有纤维素酶活性。

16、真菌的：在本发明的上下文中，术语关于多肽(如酶，例如，纤维素酶)的“真菌的”是指由真菌基因组编码并且因此可直接从真菌基因组衍生的多肽，其中这种真菌未经过遗传修饰来编码所述多肽，例如，通过重组dna技术将编码序列引入基因组中。因此，在本发明的上下文中，术语“真菌纤维素酶”或“获得自真菌来源的具有纤维素酶活性的多肽”是指由真菌物种基因组编码并且因此直接从真菌物种基因组衍生的纤维素酶，其中该真菌物种未经受通过引入编码所述纤维素酶的重组dna进行的遗传修饰。因此，编码具有纤维素酶活性的真菌多肽的核苷酸序列是天然在真菌物种遗传背景中的序列。由这种序列编码的具有纤维素酶活性的真菌多肽还可以是指野生型纤维素酶(或亲本纤维素酶)。在另一个方面，本发明提供了具有纤维素酶活性的多肽，其中所述多肽与真菌纤维素酶基本上同源。在本发明的上下文中，术语“基本上同源”表示具有纤维素酶活性的多肽与所选择的真菌纤维素酶的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地至少96％、97％、98％，以及最优选地至少99％的同一性。与真菌纤维素酶基本上同源的多肽可以被包括于本发明的洗涤剂中，和/或在本发明的方法中使用。

17、宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。

18、改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”在本文定义为相对于没有酶的相同洗涤剂组合物的洗涤性能，酶展示出在洗涤剂组合物中增加的洗涤性能，例如，通过增加去污或较少的再沉积。术语“改善的洗涤性能”包括在衣物中的洗涤性能。

19、分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。

20、衣物洗涤：术语“衣物洗涤”涉及家用衣物洗涤和工业衣物洗涤两者并且意指用含有本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。衣物洗涤过程可以例如使用例如家庭或工业洗衣机进行，或可以手动进行。

21、成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

22、成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维素酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

23、核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

24、可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

25、序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(the european molecular biology open software suite)，rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

26、(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

27、出于本发明的目的，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(emboss:the european molecular biology open software suite)，rice等人.,2000,同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

28、(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

29、可持续性：可持续性和可持续的意指使用对环境损害极小或无损害且生物可降解的可再生资源。

30、可持续性特征：在本发明的上下文中，术语可持续性特征用于比较成分(例如洗涤剂组合物中的)的可持续性，其中一种或多种成分可以替代其他可持续性较差的成分，同时保持系统的性能(例如物品洗涤期间洗涤剂组合物的性能)。

31、纺织品：术语“纺织品”意指任何纺织品材料，该任何纺织品材料包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料，由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如，服装和其他制品)。纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。该纺织品可以是基于纤维素的，如天然纤维素制品，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维，或者人造纤维素制品(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、乙酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚合物，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝，或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸酯、聚丙烯和氨纶(spandex)/弹性纤维(elastane)、或其共混物以及基于纤维素的纤维和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和/或含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、乙酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如有污渍的家用衣物。当使用术语织物或服装时，旨在也包括广义术语纺织品。在本发明的上下文中，术语“纺织品”还包括织物。在本发明的上下文中，术语“纺织品”可与织物和布料互换使用。

32、已使用或已穿着：本文所用的关于纺织品的术语“已使用或已穿着”意指已经由消费者使用或穿着或者已经与人类皮肤(例如在生产或零售期间)接触的纺织品。消费者可以是购买纺织品的人，例如，在商店购买纺织品(例如，新衣服或床上用品)的人或购买纺织品(例如，床上用品、茶巾或桌布)用于企业用途的企业，例如，酒店、饭店、专业厨房、机构、医院等。在某些情况下，此类已使用或已穿着的纺织品会带有尚未完全洗掉的常规污渍，并可以形成粘合基础，以吸引和积聚更多空气中的颗粒物。

33、变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的与亲本酶具有相同活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。在本发明的上下文中，所鉴别的纤维素酶的变体具有亲本的酶活性，即催化dna主链中的磷酸二酯键水解断裂的能力(脱氧核糖核酸酶活性)。在一个实施例中，以亲本纤维素酶(例如，seq id no:2的成熟多肽)为参比，变体的脱氧核糖核酸酶活性是增加的。

34、洗涤周期：术语“洗涤周期”在本文定义为如下洗涤操作，其中将纺织品浸泡在洗涤液中，将某种机械作用应用于该纺织品，以释放污渍，并且协助洗涤液流进和流出该纺织品，并且最终去除多余的洗涤液。在一个或多个洗涤周期后，总体上对该纺织品进行漂洗和干燥。

35、洗涤液：本文将术语“洗涤液”定义为任选地包括本发明的酶的水和洗涤剂组分的溶液或混合物。

36、洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作在洗涤期间洗涤剂组合物、酶或聚合物去除存在于有待清洁的物体上的污渍或保持纺织品的颜色和白度的能力。洗涤性能的改进可以通过计算如实验部分中所述的所称的δrem(反射)来量化。

37、重量百分比：缩写为w/w％、wt％或w％。这些缩写可互换使用。

38、白度：术语“白度”在本文定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度可以用在白色纺织品上或可互换地用作有色纺织品的亮度。白度或亮度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、污渍再沉积、污物/泥浆再沉积、污染粒子、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转移的着色。白度的损失可以包括来自以下列表的一个或几个问题：着色剂或染料作用；不完全污渍去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用过程中纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。

39、序列综述

40、seq id no:1是获得自米曲霉(aspergillus oryzae)的dna酶。

41、seq id no:2是获得自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的dna酶。

42、seq id no:3是获得自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的dna酶。

43、seq id no:4是获得自粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)的dna酶。

44、seq id no:5是获得自病研所芽孢杆菌(bacillus idriensis)的dna酶。

45、seq id no:6是分离自食物芽孢杆菌(bacillus cibi)的dna酶。

46、seq id no:7是获得自堀越氏芽孢杆菌(bacillus horikoshii)的dna酶。

47、seq id no:8是获得自芽孢杆菌属物种(bacillus sp.)的dna酶。

48、seq id no:9是获得自芽孢杆菌属物种的dna酶。

49、seq id no:10是获得自特异腐质霉(humicola insolens)的纤维素酶。

50、seq id no:11是获得自秋叶氏芽孢杆菌(bacillus akibai)的纤维素酶。

51、seq id no:12是获得自多黏类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)的纤维素酶。

52、seq id no:13是获得自热白丝菌(melanocarpus albomyces)的纤维素酶。

53、seq id no:14是获得自米曲霉的dna酶