亲和剂的制作方法

背景技术：

1、生物产生的治疗剂的纯度受到当局的严格审查和监管，以确保安全性和有效性。因此，仍然需要有效纯化生物产生的治疗剂至高纯度的手段。

技术实现思路

1、为了支持先进治疗药品(atmp)的临床努力，需要从重组来源高效纯化atmp的组合物和方法。亲和纯化是一种通过几个步骤或单个步骤分离和/或获得所需蛋白质纯度的手段。然而，亲和剂(例如，包含亲和配体)的开发可能是一项资源密集且耗时的任务，并且因此仅存在针对极少数蛋白质的亲和剂。在不存在亲和剂的情况下，纯化通常涉及低效过程，诸如多柱过程。

2、外泌体是一种新兴的atmp，具有巨大的治疗潜力(madhusoodanan 2020)。它们是细胞外囊泡的一个子类，其中还包括微泡和凋亡小体(zaborowski等人2015)。用于治疗目的的外泌体的制造困难且昂贵。细胞培养生产力低并且通常达到每升1011-1014个外泌体。纯化主要通过离子交换色谱法完成。然而，这种方法对外泌体没有选择性，因此导致与其他细胞外囊泡的共纯化并且不能充分清除宿主细胞蛋白。因此，仍然需要选择性纯化外泌体。

3、鉴于亲和纯化选择性纯化靶标的公认能力，存在对满足现代生物加工严酷条件的亲和试剂的需求。免疫亲和力，即使用抗体作为亲和配体，已证明外泌体纯化所需的选择性(kowal等人2016)。所述抗体选择性地结合外泌体特有的表面标志物，即四跨膜蛋白cd9、cd63和cd81。然而，抗体不适合生物加工和/或缺乏足够的稳定性来与消毒和清洁剂相容。因此，需要适合生物过程的亲和剂。

4、本文描述了结合外泌体并可用于分离和/或亲和纯化的亲和剂。

5、在一些实施方案中，本文提供了包含环肽的亲和剂，其还包含氨基酸序列seq idno：1，

6、seq id no：1：x1ywrb1vwfphaqgb2vx2 x2

7、其中x1代表h或n，x2代表s或t，并且b1和b2代表肽借此进行环化的单位。

8、在一些实施方案中，亲和剂包含有包含表5中所示的至少一种氨基酸序列(例如seq id no：2-126中任一者)的配体。

9、在一些实施方案中，本文提供了包含至少一种结合cd81的配体的亲和剂，所述配体包含氨基酸序列seq id no：1。

10、在一些实施方案中，本文提供了包含至少一种结合外泌体的配体的亲和剂，所述配体包含氨基酸序列seq id no：1。

11、在一些实施方案中，本文提供了包含至少一种配体的亲和剂，所述配体包含氨基酸序列seq id no：1，或相差不超过三个或不超过两个或不多于一个取代、添加或缺失的氨基酸序列。

12、在一些实施方案中，本文提供了包含多个亲和配体的亲和剂。

13、在一些实施方案中，本文提供了用于纯化外泌体的亲和剂。

14、定义

15、为了更易于理解本公开，下面定义某些术语。除非本文另外定义，否则技术和科学术语具有与本领域普通技术人员普遍理解的相同含义。

16、大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”当应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与所陈述的参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或另外由本文显而易见(除了此类数字将超过可能的值的100％的情况)，否则术语“大约”或“约”是指属于所陈述的参考值在任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低内的值的范围。

17、生物活性：如本文所用，术语“生物活性”是指在生物系统中，特别是在生物体中具有活性的任何剂的特征。例如，当施用于生物体时对所述生物体具有生物作用的剂被认为具有生物活性。

18、保守和非保守取代：“保守”氨基酸取代是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸(k)、精氨酸(r)、组氨酸(h))；酸性侧链(例如，天冬氨酸(d)、谷氨酸(e))；不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸(g)；天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、酪氨酸(y)、半胱氨酸(c))；非极性侧链(例如，丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、蛋氨酸(m)、色氨酸(w)、β-支链侧链(例如，苏氨酸(t)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i))；和芳族侧链(例如，酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、组氨酸(h))。例如，用苯丙氨酸取代酪氨酸是一种保守取代。在一些实施方案中，配体序列中的保守氨基酸取代赋予或改善配体与感兴趣的靶标的特异性结合。在一些实施方案中，配体序列中的保守氨基酸取代不会减少或消除配体与感兴趣的靶标的结合。在一些实施方案中，保守氨基酸取代不会显著影响配体与感兴趣的靶标的特异性结合。鉴定赋予、改变或保持选择性结合亲和力的核苷酸和氨基酸保守取代和非保守取代的方法是本领域已知的(参见例如，brummell，biochem.32：1180-1187(1993)；kobayashi，protein eng.12(10)：879-884(1999)；和burks，pnas 94：412-417(1997))。在一些实施方案中，配体序列中的非保守氨基酸取代赋予或改善配体与感兴趣的靶标的特异性结合。在一些实施方案中，配体序列中的非保守氨基酸取代不会减少或消除配体与感兴趣的靶标的结合。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代不会显著影响配体与感兴趣的靶标的特异性结合。

19、接头：如本文所用，“接头”是指肽或起到连接其他独立的功能性结构域的作用的其他化学键联。在一些实施方案中，接头位于配体与含有另外独立的功能性结构域的另一多肽组件之间。在一些实施方案中，接头是位于配体与表面之间的肽或其他化学键联。

20、天然存在的：术语“天然存在的”当与诸如核酸分子、多肽和宿主细胞的生物材料结合使用时，是指在自然界中发现且未经人类修饰的那些。相反，当与生物材料结合使用时，“非天然”或“合成”是指在自然界中未发现和/或已经人类修饰的那些材料。

21、“非天然氨基酸”、“氨基酸类似物”和“非标准氨基酸残基”在本文中可互换使用。可在本文所提供的配体中被取代的非天然氨基酸是本领域已知的。在一些实施方案中，非天然氨基酸是可取代脯氨酸的4-羟脯氨酸；可取代赖氨酸的5-羟赖氨酸；可取代组氨酸的3-甲基组氨酸；可取代丝氨酸的高丝氨酸；和可取代赖氨酸的鸟氨酸。可在多肽配体中取代的非天然氨基酸的其他实例包括但不限于分子，诸如：常见氨基酸的d-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、a-氨基丁酸、abu、2-氨基丁酸、γ-abu、ε-ahx、6-氨基己酸、aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸、硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸氟代氨基酸、设计师氨基酸，诸如β-甲基氨基酸、cα-甲基氨基酸和nα-甲基氨基酸。

22、“多核苷酸”和“核酸分子”：如在本文可互换使用的，多核苷酸和核酸分子是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。这些术语包括但不限于dna、rna、cdna(互补dna)、mrna(信使rna)、rrna(核糖体rna)、shrna(小发夹rna)、snrna(小核rna)、snorna(短核仁rna)、mirna(微小rna)、基因组dna、合成dna、合成rna和/或trna。

23、可操作地连接：如本文所用的术语“可操作地连接”表示两个分子附接以便各自保留功能活性。无论是直接附接还是间接附接，两个分子都是“可操作地连接”。

24、肽标签：如本文所用的术语“肽标签”是指作为另一种蛋白质的一部分或附接(例如通过基因工程改造)至另一种蛋白质，以为由此产生的融合提供功能的肽序列。与它们融合的蛋白质相比，肽标签通常相对较短。在一些实施方案中，肽标签的长度为四个或更多个氨基酸，诸如5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，配体是含有肽标签的蛋白质。具有如本文所提供的用途的许多肽标签是本领域已知的。可以是配体融合蛋白的组分或由配体结合的靶标(例如，配体融合蛋白)的肽标签的实例包括但不限于ha(血凝素)、c-myc、疱疹单纯病毒糖蛋白d(gd)、t7、gst、gfp、mbp、strep标签、his标签、myc标签、tap标签和flag标签(eastman kodak，rochester，n.y.)。同样，针对标签表位的抗体允许在例如亲和纯化、蛋白质印迹、elisa测定和细胞免疫染色中检测和定位融合蛋白。

25、多肽：如本文所用的术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的连续氨基酸链。所述术语用于指任何长度的氨基酸链，但本领域的普通技术人员将理解所述术语不限于长链并且可指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员所知，多肽可被加工和/或修饰。

26、蛋白质：如本文所用的术语“蛋白质”是指一种或多种充当离散单元的多肽。如果单个多肽是离散的功能单元并且不需要与其他多肽永久或暂时的物理缔合以形成离散的功能单元，则术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散功能单元由多于一种彼此物理缔合的多肽组成，则术语“蛋白质”是指物理偶联并作为离散单元一起发挥作用的多个多肽。

27、特异性结合：如本文所用，关于配体，术语“特异性结合”或“对......具有选择性亲和力”表示配体相比于与替代物质(包括不相关的蛋白质)的反应或缔合更频繁地、更快速地、以更长的持续时间、以更大的亲和力或以上的组合与特定表位、蛋白质或靶分子反应或缔合。由于不同物种中同源蛋白质之间的序列同一性，特异性结合可包括识别多于一个物种中的蛋白质或靶标的结合剂。同样，由于不同蛋白质的多肽序列的某些区域内的同源性，特异性结合可包括识别多于一种蛋白质或靶标的结合剂。应当理解，在某些实施方案中，特异性结合第一靶标的结合剂可能会或可能不会特异性结合第二靶标。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合，即与单一靶标结合。因此，在某些实施方案中，配体或亲和剂可特异性结合多于一个靶标。在某些实施方案中，多个靶标可被亲和剂上的相同抗原结合位点结合。

28、基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出总体或接近总体范围或程度的感兴趣的特征或特性的定性情况。生物学领域的普通技术人员应当理解的是生物学以及化学现象很少(如果有的话)会达到完成，和/或进行到完成或实现或避免绝对的结果。因此，术语“基本上”在本文中被用来获得在许多生物学以及化学现象中潜在地缺少的内在的完全性。