用于癌症诊断和预后的甲基化生物标志的分层分析

背景技术：

1、针对突变的无细胞dna(cell-free dna,cfdna)，即在血液中自由循环的片段dna的微创血液测试正进行癌症检测、疗法选择和疗法监测的测试(forshew etal.sci.transl.med.4,136ra68(2012)；dawson et al.n.engl.j.med.368,1199-1209(2013)；bettegowda et al,sci.transl.med.6,224ra24(2014)；cohen et al.,science359,926-930(2018)；corcoran&chabner n.engl.j.med.379,1754-1765(2018)；mcdonaldet al.sci.transl.med.11,eaax7392(2019))。甲基化cfdna生物标志也显示出这些应用的前景，部分原因是它们固有的生物学特性(sun et al.proc.natl.acad.sci.u.s.a.112,e5503-e5512(2015)；lamb&dhillon mol.diagn.ther.21,225-232(2017)；xu etal.nat.mater.16,1155-1161(2017)；liu et al.ann.oncol.29,1445-1453(2018)；liu etal.ann.oncol.31,745-759(2020)；luo et al.sci.transl.med.12,eaax7533(2020))。通过其启动子区域中cpg二核苷酸的甲基化使肿瘤抑制基因沉默，在肿瘤发展中起着重要、早期的作用(esteller oncogene 21,5427-5440(2002)；jones&baylin nat.rev.genet.3,415-428(2002))。甲基化dna也包绕组蛋白，保护其免受血液中核酸酶的降解(snyder etal.cell 164,57-68(2016)；mouliere et al.sci.transl.med.10,eaat4921(2018))。从技术角度看，靶向微阵列和测序平台的进展使得能够精确定量cfdna中的cpg甲基化频率(deng et al.nat.biotechnol.27,353-360(2009)；sandoval et al.epigenetics 6,692-702(2011))。

技术实现思路

1、提供了鉴定甲基化无细胞dna(cfdna)生物标志的方法，其被称为甲基化生物标志的分层分析(layered analysis of methylated biomarkers,lamb)。具体地，lamb方法可用于分析患者数据以发现与癌症相关的甲基化cfdna生物标志。利用对癌症组织甲基化研究的荟萃分析(meta-analysis)，使用lamb鉴定候选肿瘤抑制物，之后在这些肿瘤抑制物中筛选肿瘤特异性启动子cpg并分析癌性组织、邻近肿瘤的非癌性组织和健康血液样品的微阵列数据。基于此lamb方法提供了用于诊断肝癌、结直肠癌、前列腺癌和肺癌的生物标志组(组套，panels)以及用于预测肿瘤对疗法的响应的生物标志。lamb鉴定的生物标志可单独地或与一种或多种其它生物标志或相关临床参数组合地用于癌症的预后、诊断、疗法选择或监测癌症的治疗。

2、一方面，提供了诊断和治疗患者的肝细胞癌(hcc)的方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1，其中选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有hcc；和c)如果基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平，患者具有hcc的阳性诊断，则治疗患者的hcc。

3、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg选自cg08572734、cg15607538、cg08571859、cg14479889、cg03667968、cg00577935、cg02659086、cg26744375、cg09420439、cg04673590、cg08465862、cg14250130、cg00922376、cg05346841、cg13629563、cg26421310、cg17300544、cg06848185、cg22522066、cg26397188和cg24166864。在一些实施方式中，所述方法包括测量cg08572734、cg15607538、cg08571859、cg14479889、cg03667968、cg00577935、cg02659086、cg26744375、cg09420439、cg04673590、cg08465862、cg14250130、cg00922376、cg05346841、cg13629563、cg26421310、cg17300544、cg06848185、cg22522066、cg26397188和cg24166864以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illuminahumanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)处的甲基化水平。

4、治疗基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平具有hcc阳性诊断的患者的示例性方法包括但不限于手术切除hcc肿瘤、肝移植、射频消融、冷冻消融、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

5、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围是从来自一个或多个不患有hcc的对照对象的一个或多个血液样品的cfdna获得的。

6、另一方面，提供了用作诊断肝细胞癌的生物标志的在选自cg08572734、cg15607538、cg08571859、cg14479889、cg03667968、cg00577935、cg02659086、cg26744375、cg09420439、cg04673590、cg08465862、cg14250130、cg00922376、cg05346841、cg13629563、cg26421310、cg17300544、cg06848185、cg22522066、cg26397188和cg24166864和位于其200个核苷酸内的cpg位点(illumina humanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)的一个或多个cpg位点处的甲基化的无细胞dna。

7、另一方面，提供了诊断患者的肝细胞癌(hcc)的体外方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；和b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1，其中选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有hcc。

8、另一方面，提供了监测患者的肝细胞癌(hcc)的方法，所述方法包括：a)在第一时间点从患者获得第一血液样品和在之后的第二时间点从患者获得第二血液样品；和b)测量来自第一血液样品和第二血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1，其中来自第二血液样品的cfdna中的选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna升高，表明hcc正在进展，而对来自第二血液样品的cfdna中的选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna降低的检测，表明hcc没有进展。

9、在某些实施方式中，hcc是原发性肿瘤、转移或复发。

10、在某些实施方式中，第一时间点在开始对患者进行hcc治疗之前，而第二时间点在治疗期间或之后。在一些实施方式中，治疗是手术切除、肝移植、射频消融、冷冻消融、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

11、在某些实施方式中，所述方法还包括重复步骤a)和b)。

12、在某些实施方式中，所述方法还包括如果hcc正在进展则对患者增加hcc的治疗的剂量或频率、改变成不同的治疗、或者开始姑息护理(palliative care)。

13、另一方面，提供了监测患者中肝细胞癌(hcc)的复发并治疗患者的复发的方法，所述方法包括：a)在针对hcc的先前发生的治疗之后的第一时间点，这时患者通过成像或其它诊断模态表征为无癌症，从患者获得第一血液样品；b)测量来自第一血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1；c)在监测复发的时期的过程中的第二时间点从患者获得第二血液样品；d)测量来自第二血液样品的cfdna中所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1，其中第二血液样品的cfdna中选自ak055957、apc、gstp1、hoxa1、pfkp、prdm2、runx3、septin9、spint2和wif1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于第一血液样品的cfdna升高，表明hcc已复发；e)如果基于所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平，患者具有hcc的复发的阳性诊断，则治疗患者的hcc的复发；和f)随后在监测复发的时期的过程中重复步骤c)-e)。

14、另一方面，提供了诊断和治疗患者的结直肠腺癌(crc)的方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c，其中选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有crc；和c)如果基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平，患者具有crc的阳性诊断，则治疗患者的crc。

15、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg选自cg14410064、cg10908369、cg25530246、cg21938148、cg03817671、cg25046074、cg08712932、cg11664500、cg12152919、cg14017655、cg14287112、cg16347317、cg20330472、cg20611276、cg22871668、cg10480343、cg22535307、cg25520679、cg07589773、cg16697214、cg18607529、cg18810347、cg20078466、cg27633530、cg01192900、cg24041078、cg06650115、cg13096260、cg18719750、cg24732574、cg25070637、cg02884239、cg06848185、cg15044248、cg19554255、cg00800383、cg19063972、cg19184934、cg27442308、cg22441533、cg01808545、cg01194057、cg07234102、cg12584684、cg15701178和cg21782409以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illuminahumanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)。在一些实施方式中，所述方法包括测量cg14410064、cg10908369、cg25530246、cg21938148、cg03817671、cg25046074、cg08712932、cg11664500、cg12152919、cg14017655、cg14287112、cg16347317、cg20330472、cg20611276、cg22871668、cg10480343、cg22535307、cg25520679、cg07589773、cg16697214、cg18607529、cg18810347、cg20078466、cg27633530、cg01192900、cg24041078、cg06650115、cg13096260、cg18719750、cg24732574、cg25070637、cg02884239、cg06848185、cg15044248、cg19554255、cg00800383、cg19063972、cg19184934、cg27442308、cg22441533、cg01808545、cg01194057、cg07234102、cg12584684、cg15701178和cg21782409处的甲基化水平。

16、治疗基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平具有crc阳性诊断的患者的示例性方法包括但不限于crc肿瘤的手术切除、放射疗法、化学疗法、免疫疗法和生物疗法。

17、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围是从一个或多个未患crc的对照对象的一个或多个血液样品中的cfdna获得的。

18、另一方面，提供了用作诊断结直肠腺癌的生物标志的在选自cg14410064、cg10908369、cg25530246、cg21938148、cg03817671、cg25046074、cg08712932、cg11664500、cg12152919、cg14017655、cg14287112、cg16347317、cg20330472、cg20611276、cg22871668、cg10480343、cg22535307、cg25520679、cg07589773、cg16697214、cg18607529、cg18810347、cg20078466、cg27633530、cg01192900、cg24041078、cg06650115、cg13096260、cg18719750、cg24732574、cg25070637、cg02884239、cg06848185、cg15044248、cg19554255、cg00800383、cg19063972、cg19184934、cg27442308、cg22441533、cg01808545、cg01194057、cg07234102、cg12584684、cg15701178和cg21782409以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illuminahumanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)中的一个或多个cpg位点处的甲基化的无细胞dna。

19、另一方面，提供了诊断患者中的结直肠腺癌(crc)的体外方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；和b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c，其中选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有crc。

20、另一方面，提供了监测患者中的结直肠腺癌(crc)的方法，所述方法包括：a)在第一时间点从患者获得第一血液样品和在之后的第二时间点从患者获得第二血液样品；和b)测量来自第一血液样品和第二血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c，其中来自第二血液样品的cfdna中的选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna升高，表明crc正在进展，而对来自第二血液样品的cfdna中的选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna降低的检测，表明crc没有进展。

21、在某些实施方式中，crc是原发性肿瘤、转移或复发。

22、在某些实施方式中，第一时间点在开始对患者进行crc治疗之前，而第二时间点在治疗期间或之后。在一些实施方式中，治疗是crc肿瘤的手术切除、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

23、在某些实施方式中，所述方法还包括如果crc正在进展则对患者增加crc治疗的剂量或频率、改变成不同的crc治疗、或者开始姑息护理。

24、在某些实施方式中，所述方法还包括重复步骤a)和b)。

25、另一方面，提供了监测患者中结直肠腺癌(crc)的复发并治疗患者的复发的方法，所述方法包括：a)在针对crc的先前发生的治疗之后的第一时间点，这时患者通过成像或其它诊断模态表征为无癌症，从患者获得第一血液样品；b)测量来自第一血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c；c)在监测复发的时期的过程中的第二时间点从患者获得第二血液样品；d)测量来自第二血液样品的cfdna中所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c，其中第二血液样品的cfdna中选自alx4、cnrip1、col4a1、col4a2、efemp1、eya4、fbn1、hic1、ikzf1、mir34c、ndrg4、sdc2、septin9、sox21、tfpi2、tmeff2和unc5c的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于第一血液样品的cfdna升高，表明crc已复发；e)如果基于所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平，患者具有crc的复发的阳性诊断，则治疗患者的crc的复发；和f)随后在监测复发的时期的过程中重复步骤c)-e)。

26、另一方面，提供了诊断和治疗患者的前列腺腺癌(prad)的方法，所述方法包括：所述方法包括：a)从患者获得血液样品；b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1，其中选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有prad；和c)如果基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平，患者具有prad的阳性诊断，则治疗患者的prad。

27、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg选自cg00577935、cg08571859、cg11613015、cg14479889、cg14511739、cg16970232、cg22035501、cg23938220、cg08530414、cg05214748、cg05907835、cg15468095、cg02499249、cg06720425、cg12479047、cg18094781、cg20899354、cg26124016和cg15229124。在一些实施方式中，所述方法包括测量cg00577935、cg08571859、cg11613015、cg14479889、cg14511739、cg16970232、cg22035501、cg23938220、cg08530414、cg05214748、cg05907835、cg15468095、cg02499249、cg06720425、cg12479047、cg18094781、cg20899354、cg26124016和cg15229124以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illumina humanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)处的甲基化水平。

28、治疗基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平具有prad阳性诊断的患者的示例性方法包括但不限于根治性前列腺切除术、激素疗法、放射疗法、近距离放射疗法、冷冻手术、高强度聚焦超声、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

29、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围是从一个或多个未患有prad的对照对象的一个或多个血液样品中的cfdna获得的。

30、另一方面，提供了用作诊断前列腺腺癌的生物标志的在选自cg00577935、cg08571859、cg11613015、cg14479889、cg14511739、cg16970232、cg22035501、cg23938220、cg08530414、cg05214748、cg05907835、cg15468095、cg02499249、cg06720425、cg12479047、cg18094781、cg20899354、cg26124016和cg15229124以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illumina humanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)中的一个或多个cpg位点处甲基化的无细胞dna。

31、另一方面，提供了诊断患者中的前列腺腺癌(prad)的体外方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；和b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1，其中选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有prad。

32、另一方面，提供了监测患者中的前列腺腺癌(prad)的方法，所述方法包括：a)在第一时间点从患者获得第一血液样品和在之后的第二时间点从患者获得第二血液样品；和b)测量来自第一血液样品和第二血液样品的循环游离dna(circulating free dna,cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1，其中第二血液样品的cfdna中的选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于第一血液样品的cfdna升高，表明prad正在进展，而对第二血液样品的cfdna中的选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于第一血液样品的cfdna降低的检测，表明prad没有进展。

33、在某些实施方式中，prad是原发性肿瘤、转移或复发。

34、在某些实施方式中，第一时间点在开始对患者进行prad治疗之前，而第二时间点在治疗期间或之后。在一些实施方式中，治疗是根治性前列腺切除术、激素疗法、放射疗法、近距离放射疗法、冷冻手术、高强度聚焦超声、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

35、在某些实施方式中，所述方法还包括重复步骤a)和b)。

36、在某些实施方式中，所述方法还包括如果prad正在进展则对患者增加prad治疗的剂量或频率、改变成不同的prad治疗、或者开始姑息护理。

37、另一方面，提供了监测患者中前列腺腺癌(prad)的复发并治疗患者的复发的方法，所述方法包括：a)在针对prad的先前发生的治疗之后的第一时间点，这时患者通过成像或其它诊断模态表征为无癌症，从患者获得第一血液样品；b)测量来自第一血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1；c)在监测复发的时期的过程中的第二时间点从患者获得第二血液样品；d)测量来自第二血液样品的cfdna中所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1，其中第二血液样品的cfdna中选自apc、cd44、pycard、rarb和rbp1的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于第一血液样品的cfdna升高，表明prad已复发；e)如果基于所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平，患者具有prad的复发的阳性诊断，则治疗患者的prad的复发；和f)随后在监测复发的时期的过程中重复步骤c)-e)。

38、另一方面，提供了诊断和治疗患者的肺腺癌(luad)的方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781，其中选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有luad；和c)如果基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平，患者具有luad的阳性诊断，则治疗患者的luad。

39、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg选自cg11835068、cg13495205、cg17741689、cg02792792、cg08516516、cg11036833、cg14470895、cg16707405、cg23180938、cg05471296、cg05743885、cg09017619、cg15797110、cg19153763、cg20293594、cg02643054、cg05065989、cg12600174、cg18447772、cg20741169、cg22055728、cg26365299、cg02191312、cg17929687、cg04672706、cg24891539、cg24928391、cg02539083、cg05157140、cg08507422、cg20870512、cg21127068、cg24686610、cg12388007、cg03611452、cg14587524和cg25324105以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illumina humanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)。在一些实施方式中，所述方法包括测量cg11835068、cg13495205、cg17741689、cg02792792、cg08516516、cg11036833、cg14470895、cg16707405、cg23180938、cg05471296、cg05743885、cg09017619、cg15797110、cg19153763、cg20293594、cg02643054、cg05065989、cg12600174、cg18447772、cg20741169、cg22055728、cg26365299、cg02191312、cg17929687、cg04672706、cg24891539、cg24928391、cg02539083、cg05157140、cg08507422、cg20870512、cg21127068、cg24686610、cg12388007、cg03611452、cg14587524和cg25324105处的甲基化水平。

40、治疗基于所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平具有luad阳性诊断的患者的示例性方法包括但不限于肺切除术、肺叶切除术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

41、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围是从一个或多个未患有luad的对照对象的一个或多个血液样品中的cfdna获得的。

42、另一方面，提供了用作诊断肺腺癌的生物标志的在选自cg11835068、cg13495205、cg17741689、cg02792792、cg08516516、cg11036833、cg14470895、cg16707405、cg23180938、cg05471296、cg05743885、cg09017619、cg15797110、cg19153763、cg20293594、cg02643054、cg05065989、cg12600174、cg18447772、cg20741169、cg22055728、cg26365299、cg02191312、cg17929687、cg04672706、cg24891539、cg24928391、cg02539083、cg05157140、cg08507422、cg20870512、cg21127068、cg24686610、cg12388007、cg03611452、cg14587524和cg25324105以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illumina humanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)中的一个或多个cpg位点处的甲基化的无细胞dna。

43、另一方面，提供了诊断患者中的肺腺癌(luad)的体外方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；和b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781，其中选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有luad。

44、另一方面，提供了监测患者中的肺腺癌(luad)的方法，所述方法包括：a)在第一时间点从患者获得第一血液样品和在之后的第二时间点从患者获得第二血液样品；和b)测量来自第一血液样品和第二血液样品的无细胞dna(cfdna)中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781，其中来自第二血液样品的cfdna中的选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna升高，表明luad正在进展，而对来自第二血液样品的cfdna中的选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna降低的检测，表明luad没有进展。

45、在某些实施方式中，luad是原发性肿瘤、转移或复发。

46、在某些实施方式中，第一时间点在开始对患者进行luad治疗之前，而第二时间点在治疗期间或之后。在一些实施方式中，治疗是肺切除术、肺叶切除术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

47、在某些实施方式中，所述方法还包括重复步骤a)和b)。

48、在某些实施方式中，所述方法还包括如果luad进展则对患者增加luad治疗的剂量或频率、改变成不同的luad治疗、或者开始姑息护理。

49、另一方面，提供了监测患者中肺腺癌(luad)的复发并治疗患者的复发的方法，所述方法包括：a)在针对luad的先前发生的治疗之后的某一时间点，这时患者通过成像或其它诊断模态表征为无癌症，从患者获得第一血液样品；b)测量来自第一血液样品的无细胞dna(cfdna)中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781；c)在监测复发的时期的过程中从患者获得第二血液样品；d)测量来自第二血液样品的cfdna中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781，其中第二血液样品的cfdna中的选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于第一血液样品的cfdna升高，表明luad已复发；e)如果基于所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平，患者具有luad的复发的阳性诊断，则治疗患者的luad的复发；和f)随后在监测复发的时期的过程中重复步骤c)-e)。

50、另一方面，提供了诊断和治疗患者中的肺鳞状细胞癌(lusc)的方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781，其中选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化的参考值范围升高，表明患者患有lusc；和c)如果基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平，患者具有lusc的阳性诊断，则治疗患者的lusc。

51、在某些实施方式中，所述cpg选自cg13495205、cg02792792、cg08516516、cg11036833、cg05471296、cg05743885、cg09017619、cg10474350、cg15797110、cg19153763、cg20293594、cg02643054、cg05065989、cg12600174、cg16104915、cg18447772、cg20741169、cg22055728、cg02191312、cg17929687、cg24928391、cg24896649、cg05548555、cg06369327、cg21127068、cg03355998、cg12388007、cg03611452、cg14587524和cg25324105以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illumina humanmethylation450k manifest中给出了这些cpg位点的位置)。在一些实施方式中，所述方法包括测量cg13495205、cg02792792、cg08516516、cg11036833、cg05471296、cg05743885、cg09017619、cg10474350、cg15797110、cg19153763、cg20293594、cg02643054、cg05065989、cg12600174、cg16104915、cg18447772、cg20741169、cg22055728、cg02191312、cg17929687、cg24928391、cg24896649、cg05548555、cg06369327、cg21127068、cg03355998、cg12388007、cg03611452、cg14587524和cg25324105处的甲基化水平。

52、治疗基于所述一个或多个cpg位点的甲基化水平具有lusc阳性诊断的患者的示例性方法包括但不限于肺切除术、肺叶切除术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

53、在某些实施方式中，所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围是从一个或多个未患lusc的对照对象的一个或多个血液样品中的cfdna获得的。

54、另一方面，提供了用作诊断肺鳞状细胞癌的生物标志的在选自cg13495205、cg02792792、cg08516516、cg11036833、cg05471296、cg05743885、cg09017619、cg10474350、cg15797110、cg19153763、cg20293594、cg02643054、cg05065989、cg12600174、cg16104915、cg18447772、cg20741169、cg22055728、cg02191312、cg17929687、cg24928391、cg24896649、cg05548555、cg06369327、cg21127068、cg03355998、cg12388007、cg03611452、cg14587524和cg25324105以及位于其200个核苷酸内的cpg位点(illumina humanmethylation450kmanifest中给出了这些cpg位点的位置)的一个或多个cpg位点处甲基化的无细胞dna。

55、另一方面，提供了诊断患者中的肺鳞状细胞癌(lusc)的体外方法，所述方法包括：a)从患者获得血液样品；和b)测量来自血液样品的无细胞dna(cfdna)中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781，其中选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于cfdna中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化参考值范围升高，表明患者患有lusc。

56、另一方面，提供了监测患者中的肺鳞状细胞癌(lusc)的方法，所述方法包括：a)在第一时间点从患者获得第一血液样品和在之后的第二时间点从患者获得第二血液样品；和b)测量来自第一血液样品和第二血液样品的循环游离dna(cfdna)中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781，其中来自第二血液样品的cfdna中的选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna升高，表明lusc正在进展，而对来自第二血液样品的cfdna中的选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于来自第一血液样品的cfdna降低的检测，表明lusc没有进展。

57、在某些实施方式中，lusc是原发性肿瘤、转移或复发。

58、在某些实施方式中，第一时间点在开始对患者进行lusc治疗之前，而第二时间点在治疗期间或之后。在一些实施方式中，治疗是肺切除术、肺叶切除术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或生物疗法。

59、在某些实施方式中，所述方法还包括重复步骤a)和b)。

60、在某些实施方式中，所述方法还包括如果lusc正在进展则对患者增加lusc治疗的剂量或频率，改变成不同的lusc治疗，或者开始姑息护理。

61、另一方面，提供了监测患者中的lusc的复发并治疗患者的复发的方法，所述方法包括：a)在针对lusc的先前发生的治疗之后的某一时间点，这时患者通过成像或其它诊断模态表征为无癌症，从患者获得第一血液样品；b)测量来自第一血液样品的无细胞dna(cfdna)中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781；c)在监测复发的时期的过程中从患者获得第二血液样品；d)测量来自第二血液样品的cfdna中的一种或多种生物标志基因的启动子区域中的一个或多个cpg位点处的甲基化水平，其中所述一种或多种生物标志基因选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、tac1、uncx、zic4和znf781，其中第二血液样品的cfdna中的选自ajap1、cdo1、hoxa7、hoxa9、ptgdr、sox17、zfp42、zic4和znf781的所述一种或多种生物标志基因的启动子区域中的所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平相比于第一血液样品的cfdna升高，表明lusc已复发；e)如果基于所述一个或多个cpg位点处的甲基化水平，患者具有lusc的复发的阳性诊断，则治疗患者的lusc的复发；和f)随后在监测复发的时期的过程中重复步骤c)-e)。

62、在主题方法的实践中，可使用用于测量cpg位点处甲基化水平的任意合适的方法，包括但不限于甲基化特异性聚合酶链式反应(pcr)、定量甲基化特异性pcr、甲基化敏感性dna限制酶分析、甲基化特异性焦磷酸测序、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、tet辅助吡啶硼烷测序(taps)、基于甲基化dna免疫沉淀的测序、基于甲基化dna免疫沉淀的微阵列分析、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析或基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。