蛋白M类似物和融合蛋白及其用于抑制抗体功能的用途

本发明涉及用于结合抗体的方法和组合物。这些方法可以用于分离抗体，治疗与过量抗体相关的疾患，急性阻断抗体以阻止自身免疫或炎症反应，以及抑制中和抗体。在实施方案中，本发明涉及在向受试者施用异源剂时，抑制针对该异源剂的中和抗体的方法，包括向受试者施用有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物，从而抑制该异源剂的中和。本发明还涉及相对于野生型蛋白m具有增加的热稳定性的修饰的支原体蛋白m或其功能片段及其在本发明方法中的用途。

背景技术：

1、美国约有1/10人患有罕见的遗传病，其能够严重影响寿命、生活质量、独立性和经济潜力。基因治疗是矫正遗传性疾病最有希望的治疗形式。在基因治疗递送载体中，腺相关病毒(aav)载体已在许多临床试验中显示出治疗效果。首个fda批准的基因治疗已经被用于失明患者。aav基因治疗的临床试验数量大幅增加，这是由于它能够安全、成功地靶向多种不同类型的器官进行长期治疗性基因表达。尽管在临床上取得了成功，但aav介导的基因递送的主要障碍是中和抗体(nabs)的高发生率，其阻碍了靶组织的载体转导。超过90％的普通人群通过自然感染暴露于aav，超过50％的人对于针对aav的nabs呈血清阳性。在临床试验筛选期间鉴定高于特定阈值的预先存在的nabs使患者失去登记的资格，因为nabs严重削弱了治疗的有效性并导致结果的可变性。

2、为了克服aav nabs，已经采用了几种方法：连续血浆置换、免疫抑制药物和改变载体衣壳以消除免疫表位。血浆置换是低效的，需要多轮以在每个阶段去除2-3倍的剩余nabs，并且仅能够处理低滴度的nabs。血浆置换也很费时，并且通过同时消耗抗体和重复静脉内针头暴露使患者处于院内感染的传播风险中。用甾体或药理学免疫抑制来杀死b细胞会带来重大的健康风险，并且需要延长方案以减少甚至10倍的nabs。aav衣壳工程化是一种创新的方法，但最终不足以对抗多克隆抗aav血清，在体内观察到抗体逃逸适度增加10倍。此外，修饰衣壳结构以改变nab识别表位通常会导致效力较低的载体和缺陷载体产生，因为这些改变的表面区域是多功能的。目前没有一种方法能够成功克服临床试验排除的高于典型阈值的预先存在的抗aav nabs，或允许重复施用相同的aav载体。

3、支原体蛋白m已被鉴定为能够非特异性结合抗体并阻断其结合抗原的能力(美国专利号9,593,150；美国公开号2017/0320921)。

4、本发明通过提供基于载体非依赖性蛋白(vector independent protein)的方法来普遍地阻断nabs和基于抗体结合的其他方法和组合物克服了本领域的缺点。

技术实现思路

1、本发明部分基于一种基于载体非依赖性蛋白的方法的开发，该方法可普遍阻断nabs，并证明该方法对浓度范围广泛的预先存在的nab有效。本发明首创了一种独一无二的支原体衍生蛋白及其类似物(称为蛋白m)的用途，以通过向受试者施用异源剂后通过nabs防止异源剂(例如aav载体)的中和，实现成功的基因递送。表明了，蛋白m通过与抗体轻链和重链上的保守区域普遍地结合，以物种和抗原非依赖性的方式阻断哺乳动物igg、igm和iga抗体类别，从而导致与抗原识别cdr区域的结构性干扰。蛋白m以纳摩尔亲和力结合抗体，并防止多种不同的测试免疫球蛋白/抗原对的抗原-抗体结合。发明人发现，蛋白m阻断aav的抗体识别，并防止抗体介导的aav的中和。已经证明，aav载体从nabs逃逸的水平与nab滴度和体积、蛋白m的量和aav的量成正比。在体外和体内，使用人类血清(ivig)和aav免疫小鼠的血清证实了蛋白m介导的nab逃逸。已经证明，蛋白m可以在aav施用之前单独施用，或与aav一起配制用于nab逃逸。这种方法的有效性取决于在aav被中和前蛋白m与免疫球蛋白的相互作用。这种方法能够用于克服针对多种异源剂(例如，aav载体血清型)的nabs，同时保持每种剂在特定基因治疗应用中的独特或有益的性质。

2、本发明还涉及蛋白m在有益的抗体结合的其他方法中的用途，包括自身免疫性疾患的治疗、与过量抗体相关的疾患的治疗、分离抗体的方法以及执行免疫测定的方法。

3、本发明还涉及具有增加的热稳定性和/或其他有利特征(例如，相对于野生型支原体蛋白m或其功能片段增加或维持的ph稳定性)的修饰的蛋白m，其用于在体内或在升高的温度下实施本发明的方法。

4、因此，本发明的一方面涉及修饰的支原体蛋白m或其功能片段，具有相对于野生型支原体蛋白m或其功能片段增加或维持该支原体蛋白m或其功能片段的热稳定性和/或ph稳定性的一个或多个氨基酸突变。在一些实施方案中，热稳定性维持在高达75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃或38℃，和/或ph稳定性维持在2至8的ph、2.5至7.5的ph或4.5至7.5的ph。

5、本发明的另一方面涉及包含修饰的支原体蛋白m或其功能片段、接头和肽的融合蛋白。

6、本发明的另一方面涉及编码本发明的修饰的支原体蛋白m或其功能片段的多核苷酸和包括该多核苷酸的载体或转化细胞。

7、本发明的另一方面涉及一种通过在向受试者施用异源剂后通过中和抗体来抑制异源剂的中和的方法，包括向受试者施用有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物，从而抑制异源剂的中和。

8、本发明的另一方面涉及在受试者中表达多肽或功能性核酸的方法，包括向受试者施用(a)编码该多肽或功能性核酸的核酸递送载体，以及(b)有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物，从而在受试者中表达该多肽或功能性核酸。

9、本发明的另一方面涉及一种治疗有需要的受试者的疾患的方法，其中所述疾病可通过在受试者中表达多肽或功能性核酸来治疗，包括向受试者施用(a)治疗有效量的编码多肽或功能性核酸的核酸递送载体，和(b)有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物，从而治疗受试者的疾患。

10、本发明的另一方面涉及编辑受试者基因的方法，包括向受试者施用(a)基因编辑复合物，和(b)有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物，从而在受试者中表达多肽或功能性核酸。

11、本发明的另一方面涉及一种治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物，从而治疗自身免疫性疾病。

12、本发明的另一方面涉及一种治疗有需要的受试者的与过量抗体相关的疾患的方法，包括向受试者施用治疗有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物，从而治疗与过量抗体相关的疾患。

13、本发明的另一方面涉及一种治疗和/或预防有需要的受试者的与受体抗体对移植物的识别相关的实体器官的急性移植物排斥的方法，其包括在移植之前和/或之后向受试者施用治疗有效量的支原体蛋白m或其功能片段或衍生物。

14、本发明的另一方面涉及从样品中分离包含抗体轻链可变区和/或重链可变区的化合物的方法，该方法包括将该化合物与附着于固体载体的本发明的修饰的支原体蛋白m或其功能片段接触，然后从修饰的支原体蛋白m或其功能片段中洗脱该化合物。

15、本发明的另一方面涉及进行免疫测定的方法，该方法包括使用本发明的修饰的支原体蛋白m或其功能片段去结合包含抗体轻链可变区和/或重链可变区的化合物。

16、本发明的另一方面涉及包括本发明的修饰的支原体蛋白m或其功能片段的试剂盒。

17、本发明的这些和其他方面在下文对本发明的描述中更详细地阐述。