富勒烯磷酸盐聚二没食子酰以及方法与流程

本发明是具有一个或更多个聚没食子酰官能团的巴克明斯特富勒烯组合物，其中这些可以是奎宁酸酯(儿茶素)，或三羟基苯基基团或二羟基苯基基团中的至少一种的苯并-氢吡喃，并且还可以包含磷酸二钠基团，以维持或重建毒物兴奋效应以及健康的细胞稳态。这种组合物的一种制剂用于局部美容产品，以减轻皮肤老化中的细胞影响。这种组合物的另一种配方制剂对抗细菌感染，如牙周病，尤其是在抗生素抗性细菌的情况下。上述效用与其他用途的同时和协同作用用于预防或帮助治疗易感细胞中不受控制的细胞增殖、肿瘤、与癌症相关的退化性恶性肿瘤和一些慢性炎症性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病，以及呼吸系统疾病，如慢性阻塞性肺病(copd)。所提供的递送方法包括摄入、局部施用、口腔施用、吸入或注射。该组合物可配制成预防性药物或用作食品补充剂。

背景技术：

1、绿茶被认为是世界上最有效的防癌饮料。各种茶叶提取物的防癌特性众所周知，并且与黄烷醇衍生物或类黄酮的一组多酚有明确的关联。这些类黄酮具有被称为黄烷-3-醇的化学结构，每个黄烷-3-醇都具有2-苯基-3,4-二氢-2h-色烯-3-醇骨架。在这些黄烷-3-醇中，绿茶中有四种被确认为最能预防癌症的发生的高度相似、结构相关的儿茶素分子。这些儿茶素为表儿茶素(ec)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)、表没食子儿茶素(egc)和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)。相似的结构和命名有时会引起一些混淆。然而，在对比医学研究中，egcg已经被证实在这些儿茶素变体中具有最有效、最突出的抗癌特性，这可能是因为相应更低分子量的物质反应性更强且热稳定性更低。

2、另一类同样具有苯并氢吡喃基团的分子是单宁，其具有至少一个中心葡萄糖分子作为其显著特征。当衍生的苯上带有羟基(oh)时，这些基团也被称为苯酚基团。单宁的种类很多，他们结构中所含苯二酚和苯三酚基团的数量十分宽泛。由于溶解度差，许多单宁可能变得太大而无法有效使用，特别是当多个葡萄糖基团被夹带到其结构中时。在单宁家族中，有一个被称为单宁酸或五-间-二没食子酰-葡萄糖的非常简单的分子成员，已经发现该分子的分子量足够低并且结构也足够可再现，可以进行抗癌和抗菌特性的医学评估。迄今为止，医学研究和报告表明单宁酸在抗增殖功能方面的可复现性与egcg的功效大致相同，这表明egcg和单宁酸均为未来开发提升其抗癌特性的理想候选物质。据认为，egcg和单宁酸抗癌特性是因为它们在其外部分子结构中表达二羟基苯基或三羟基苯基(更普遍的是聚没食子酰基)官能性。

3、egcg在室温下的最大溶解度为每升水92g。绿茶中的egcg可诱导癌细胞凋亡。每升冲泡的绿茶中最多含有约1.25g egcg。流行病学研究表明，每天最低摄入2.5至3g的egcg，使得血清中egcg的浓度达到0.1-1mm，从而降低患癌症的风险。

4、多项研究表明，egcg多酚对于抵抗多种与氧化应激损伤细胞相关的(慢性)病症具有有益作用，包括多种类型的癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。此外，egcg还提供显著的抗菌和抗病毒特性，可用于治疗阿尔茨海默病。请参阅sneideris等人的“theenvironment is a key factor in determining the anti-amyloid efficacy ofegcg,”biomolecules,2019,9,855，以及yang等人的“egcg-mediated protection of themembrane disruption and cytotoxicity caused by the‘active oligomer’of alpha-synuclein,”scientific reports,2017,7,17945，示出了egcg抑制与阿尔茨海默病相关的beta淀粉样斑块以及与帕金森病相关的alpha突触核蛋白斑块的生长。此外，在mahler等人(2020)“neuroprotective properties of green tea(camellia sinensis)inparkinson’s disease:areview”molecules，2020,25,3926中，示出了egcg通过调节多种基因表达和作用于线粒体redox信号传递通路，对于治疗帕金森病也有类似作用。rady等人的报告“cancer preventive and therapeutic effects of egcg,the major polyphenolin green tea,”egyptian journal of basic and applied sciences,5(2018)1-23中对egcg的抗癌特性进行了回顾和讨论，其抗癌特性源自于p53蛋白、p21蛋白、p27蛋白的活性，以及其他蛋白激酶在缓解结肠直肠癌、肺癌、口腔癌、鳞状细胞癌、宫颈癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中的作用。这些报告讨论了egcg儿茶素多酚的医疗功效。

5、口服egcg时，egcg在经过肠道期间保持稳定。在被肠道吸收后，egcg会被肠道细胞代谢。被消化的儿茶素(如ec和egcg)往往会生成葡萄糖醛酸，之后可被部分甲基化，形成3-o-甲基基团。这意味着氧化的儿茶素是甲基化过程的引物，并且会去除并且化学结合来自内源性甲基化剂的甲基基团。dna甲基化很有可能是导致癌症发病的原因之一。多酚类儿茶素的氧化甲基化代谢物可能有助于减轻其他甲基化功能失调，这些功能失调通常与表观基因组的随机化以及衰老过程有关。癌症只是众多可能导致躯体疾病和神经疾病的累积性错误中的一种。值得注意的是，甲基化拮抗剂是科学医学研究的一个领域。因此，人们普遍认识到，儿茶素和egcg的医疗用途需要更多的关注和创新，并且由于发现egcg与其他分子的结合在对抗认知疾病方面具有协同作用，并在目前受到广泛关注，预防癌症可能并不是这种材料或其衍生物在未来找到新应用的唯一医学目的。

6、众所周知并且其特征是，egcg可直接与肿瘤抑制蛋白分子p53结合。egcg通过促进丝氨酸残基的磷酸化来稳定人体细胞中的p53蛋白，从而使得细胞生长停滞。当位于细胞核中时，p53蛋白是一种dna转录因子。在一半以上的已知癌症中，当p53发生不良突变时，它也无法发出细胞核dna修复过程的信号。

7、通过泛素化以及之后的降解，p53通常在健康细胞中保持低浓度，除非或直到需要它的时候。当因局部功能失调而产生足够的细胞应激而被激活时，当p53位于细胞质或线粒体中时它会促进细胞周期停滞或程序性细胞死亡(细胞凋亡)。这些功能失调可能包括导致细胞增殖形成肿瘤也可能是癌症的氧化应激和dna损伤。

8、n端结构域(ntd)处于无序状态，缺乏折叠结构，并且具有高灵活性的且低结合亲和力的伸展构象。小分子必须能够将ntd转变为高分子结合亲和力的紧凑构象。目前，容易理解的是，肿瘤抑制蛋白p53的ntd是药物开发中抗癌效用的绝佳靶点，其通过增强ntd与靶向小分子的相互作用，生成紧凑的分子复合物，但是尽管迄今为止对于该话题有着许多猜测和讨论，这种设计并不同时具有高效和有效的特性，也并没有形成靶向递送的方法。

9、肿瘤抑制蛋白p53的ntd是一种内在无序蛋白，通常与包括调控e3连接酶mdm2在内的许多信号传递蛋白进行相互作用。任何蛋白质与泛素的反应都是向蛋白酶体发出的信号，为降解和分解而被标记。在不需要使衰老细胞发生程序性细胞死亡时，mdm2的功能为加速p53的泛素化以及之后的降解。一些小分子可以抑制p53的泛素化，从而使其具有抗肿瘤活性可用于抗肿瘤。ntd中的a螺旋疏水侧包含位于中心位置的色氨酸残基w23，其被认为最容易被能直接与该区域结合的小分子破坏。

10、以前的抗肿瘤和癌症预防药物发现尝试旨在破坏p53-mdm2界面的ntd-结合口袋，该结合口袋可与mdm2表面相互作用。与mdm2结合是p53的ntd的一项众所周知的功能，包括全局亲水性氨基酸残基f19、l22、l26和中心定位的亲水性w23色氨酸残基。这些氨基酸残基近端被许多羧酸官能团和亲水脯氨酸残基包围，这有助于在细胞质中保持开放且无序的ntd构象。这些信息可在蛋白质数据库(pdb)命名为2xwr的x射线晶体结构中公开查阅(可通过rcsb.org/structure/2xwr查阅)，示出了具有伸展的n末端的人类p53 dna结合结构域。以同样的方式，与p53的转录激活结构域结合的mdm2也可在https://www.rcsb.org/structure/1ycr上公开获取。从长远来看，一些人考虑将mdm2蛋白连接酶与另一种抑制剂相结合，来避免与p53发生相互作用，例如可以在rcsb.org/structure/4zfl中可以。

11、p53的极端n末端是色氨酸残基91的吲哚环与精氨酸残基174的近端共面盐酸胍基团在0.36纳米的垂直距离上的阳离子-π相互作用。这些氨基酸残基被许多羧酸官能团围绕，这些官能团有助于在细胞质中保持开放且无序的ntd构象，因此，理所当然酸性分子最有可能在氨基酸残基色氨酸91或其周围以mdm2的方式形成相互作用，从而防止mdm2在该位置对接。

12、作为一种具有高络合形成能力的酸性小分子，egcg能够与p53的ntd结合，来破坏p53-mdm2相互作用。据报道，egcg能破坏人肺癌细胞中mdm2和p53的相互作用，从而抑制p53的泛素化和之后的降解。egcg的效用是增加p53的整体细胞浓度，以及提高引起细胞凋亡效应的能力。

13、然而，egcg优异的水溶性(每升水92g)限制了这种多酚分子穿过脂质细胞膜并渗透到疏水性细胞区域的能力。这基本上解释了为什么需要持续高剂量的egcg来通过与细胞质内或细胞核内的p53结合来降低患癌症的风险，其中跨细胞膜的转移对于到达p53蛋白至关重要。

14、酸性p53结合物必须能够渗透细胞脂质膜以给予保护，预防氧化和硝化应激影响细胞核中负责产生p53的基因。一些当前的治疗策略强调在分子或颗粒中设计多种功能特性，使其能够靶向酶或受体，来帮助纠正导致癌症疾病状态的功能失调。其中，没有一个能够以任何组合表达脂质膜渗透性和酸性亲水特性的正确组合，以对p53蛋白进行操作或对编码它的脱氧核糖核酸(dna)提供保护。

15、尽管egcg的有益作用前景广阔，但还没有已知的策略来提升其不良的稳定性，防止快速代谢分解，以将这种物质输送到发现p53的生成出现了突变或缺陷的衰老细胞中。尝试在微球或纳米颗粒内进行封装或尝试在聚合物基质中进行分子分散以用作载体，已被证明对于递送是有效的，但以目前的手段仍不能充分靶向蛋白p53的泛素化位点。

16、在所有情况下，现阶段本领域尚未考虑过而将表没食子儿茶素没食子酸酯与特别设计的能够储存和释放电子和氢质子的还原-氧化(redox)中心相连接，使其能够进行氧化还原循环，目的是循环表没食子儿茶素没食子酸酯的活性羧基，来帮助长期维持细胞氧化还原稳态。此外，目前还没有制剂被明确设计为用于确保递送、释放或游离的表没食子儿茶素没食子酸酯可以渗透到并保留在细胞器膜的活性分子信号传递和生化还原氧化位点上。这种情况的部分原因可能是当前制剂使用的靶向技术不能充分地提供表没食子儿茶素没食子酸酯同时静电和疏水锚定到细胞膜上。另一个原因可能是缺乏明确定义的功能或机制来渗透疏水性蛋白质，尤其是含有硫-硫桥的蛋白质。

17、使用膳食egcg的一个重要限制是细胞信号传递的设计不够成熟。这种设计失败归因于细胞信号传递功能和蛋白质信息传递效应的理解不全面。细胞信号的相互作用始于膜上的表面电荷。表面电荷与细胞的细胞膜、蛋白质、dna和脂质膜接触。一些信号传递区域，例如肿瘤内线粒体的内质网和肌质网上的位点，可能会出现未充分参与氧化的情况，这与过剩糖酵解的发展、蜡状疏水蛋白质与过量谷胱甘肽形成网络以及其他含硫分子有关。这种redox的缺失被认为会导致电子传递循环功能失调，电子传递循环使得发生正常的细胞呼吸，其结果可能是产生折叠错误的蛋白质，这种蛋白质与肿瘤或癌症对凋亡带来的程序性细胞死亡的抵抗力有关。遗憾的是，目前开发改良药品和营养保健品的趋势表明了其对细胞信号传递的控制有限，而且并未成功改进p53的留存率，以对抗肿瘤和癌症的发病率。

18、因此，需要用于保护细胞p53的新的治疗策略或独特的材料，并在不可逆损伤发展之前，预防、减轻或逆转与p53功能失调有关的肿瘤或癌症所引起的毒性疾病。理想情况下，这种治疗方法应包括即使在还原条件下也能去除自由基来源的手段，以包括非常局部和非常靶向的酸性功能性，同时还保有渗透脂质膜的能力。据信，本发明首次广泛有效地提供了这样的组合物，它具有生物和电化学设计，以赋予高度靶向的p53蛋白质结构多种治疗和预防功能，并且尤其影响细胞核中的dna。这种组合物将改变我们对提高抗癌效应的应用的看法。使用不同的载体制剂可以为这种新型组合物提供适当的施用方法。

技术实现思路

1、本发明是独特的富勒烯聚二没食子酰纳米颗粒组合物，由市售可得的巴克明斯特富勒烯(任选包括磷酸二钠(fdsp)基团)与聚二没食子酰(例如五-间-二没食子酰-葡萄糖)或儿茶素(例如表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg))反应制备得到。

2、目的是提供化合物，其通过在疏水区域的可渗透性以及儿茶素(例如结构为c22h18o11的表没食子儿茶素没食子酸酯)的生物可氧化还原功能性来提高其生物利用率，尤其是在水溶液中的溶解性。

3、本发明提供了化合物的首次广泛有效的发现，其具有生物和电化学设计以赋予多种治疗和预防功能。例如，所述的载体制剂、衍生物和组合物使得能够实现适当的施用方法以及其药物用途。

4、本发明的一些实施方案提供了由碳富勒烯(任选地与氧化态为3的磷酸盐共价衍生)和聚二没食子酰(例如儿茶素部分，优选egcg)组成的纳米颗粒团簇，其中该物质至少有一个羰基(c＝o)与富勒烯磷酸盐的芳香区域π-羰基键合。这使得egcg在水溶液中的溶解度特别高，从而提高了egcg的生物利用率及其治疗效果。

5、侧链酸性磷酸盐与阳离子(优选钠)中和，以通过磷酸盐硫化反应形成具有表面活性剂性质且具有病毒或真菌蛋白酶抑制功能的磷酸二钠基团。例如，富勒烯磷酸二钠基团的通式为(c60((op(ona)2)5)x-ry，其中r为选定的儿茶素多酚或五-间-二没食子酰基-葡萄糖。优选地，r为egcg。

6、在一个优选实施方案中，y是1或2，例如巴克明斯特富勒烯的衍生物,分别具有化学式c60((op(ona)2)5-c22h18o11或c60((op(ona)2)5-c22h18o11)2。

7、这种富勒烯衍生物所具有的特性，反映了富勒烯的独特的自由基清除化学功能、酸性儿茶素多酚的抗增殖功能以及阳离子磷酸二钠的蛋白酶控制功能。

8、这些特性使得组合物能够渗透蜡质硫化蛋白，来实现过度甲基化的局部化学淬灭，并减少p53抗肿瘤蛋白的泛素化，这对于减少和纠正dna损伤至关重要。

9、特别地，儿茶素多酚基团(如egcg)具有抗癌特性。通过细胞膜上靶向的氧化还原反应，提高聚二没食子酰基团的生物利用率，巴克明斯特富勒烯衍生物增强或提高了儿茶素多酚基团的药物特性。在一些实施方案中，通过提供储存的电子或质子，巴克明斯特富勒烯基团可使egcg的羟基和羧基重复氧化还原，以在多种生物氧化还原反应中作为中间体进行调节。众所周知，氧化还原反应往往发生在细胞膜上，尤其发生在细胞器的内部膜结构上。巴克明斯特富勒烯加合物的疏水性和亲脂性碳面的存在极大地提升了后一种能力，它被吸引并随后锚定在细胞膜脂质中，正如在30多年的富勒烯生化研究中所充分记录的那样。例如，将egcg加合物提供给巴克明斯特富勒烯，可有效地将该分子中的儿茶素多酚部分靶向于膜表面的生物活性位点，其中其活性将在调节和控制氧化还原稳态方面发挥最大的细胞效用，并且自由基最有可能聚集并破坏细胞膜的完整性。

10、在一个方面，fdsp的儿茶素官能团的多羟基区域会被牺牲性甲基化。适合用作牺牲性甲基化分子和甲基化拮抗剂的fdsp儿茶素包括表儿茶素(ec)、表儿茶素没食子酸酯(egg)、表没食子儿茶素(egc)和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)。

11、在一个相关方面，fdsp-egcg被用作甲基化拮抗剂，其中fdsp-egcg在儿茶素官能团的羟基区域被牺牲性甲基化，以此控制由于系统衰老过程而导致的功能失调的甲基化。这一过程是由聚没食子酰基奎宁酸酯官能团实现的，其中更多的官能团提供更多数量的甲基化沉淀，其代价是局部反应性更低，但fdsp-儿茶素的长期稳定性却得到了改善。具体来讲，fdsp-egcg组合物通过牺牲fdsp-egcg充当去甲基化剂(也被称为甲基化拮抗剂)来保护表观基因组免受甲基化诱导的衰老。这种作用保护了表观基因组上甲基(-ch3)官能团的过度化学积累，以维持对生物体功能至关重要的正常基因表达。

12、在另一个相关方面，fdsp-egcg有助于调节表观遗传甲基化机制，包括dna甲基化、组蛋白修饰和非编码rna之间的串扰，以及甲基化对基因表达的影响。具体来说，fdsp-egcg控制导致肿瘤和癌细胞的疾病发展的甲基化失调。因此，通过fdsp-egcg的牺牲性甲基化来提取甲基，为避免肿瘤和癌细胞的生成提供了一条途径。

13、在另一个相关方面，fdsp-egcg限制神经系统疾病中的认知能力下降。在路易体痴呆症和帕金森病中，左旋多巴会发生甲基化，导致在谷氨酸循环中由左旋多巴代谢而来的神经递质多巴胺功能丧失，导致大脑黑质区中形成α-突触核蛋白斑块。在阿尔茨海默病中，过度甲基化被淬灭，以限制β淀粉样蛋白斑块的形成和结块。fdsp-egcg组合物通过侧链羟基苯基基团的牺牲性甲基化提供了去甲基化特性，该基团因c60富勒烯加合物的存在而被化学激活。通过fdsp-egcg通过牺牲甲基化提取甲基基团，可保护多巴胺及其前体左旋多巴等神经递质免受甲基化导致的功能性失活。

14、在另一个方面，fdsp-egcg的牺牲性去甲基化功能可保护p53蛋白的功能区免受甲基化，以便p53能够继续在dna周围以及在肿瘤和癌细胞上进行修复工作。

15、在另一个方面，fdsp-egcg组合物通过侧链磷酸盐基团的牺牲性氧化提供脱硫特性。过量硫的区域是由局部过量的谷胱甘肽产生的，导致与蜡质区域相关的疏水性硫-蛋白质键，将肿瘤细胞与天然免疫系统分开。通过fdsp-egcg从交联的和错误折叠的蜡状蛋白团聚体中提取硫，形成一种肿瘤和癌细胞的独特渗透模式，使天然免疫应答能够更好地进入这类细胞。

16、在一个相关方面，脱硫功能的作用是释放截留的p53蛋白，这些蛋白可能会折叠成蛋白缠结并与之交联，该蛋白缠结与肿瘤和癌细胞周围区域中过量谷胱甘肽有关。

17、在另一个方面，fdsp-egcg与tp53(p53)蛋白形成复合物，以避免泛素信号传递标签，否则泛素信号传递标签可能会缩短p53dna修复蛋白的有效寿命。fdsp-egcg键合至p53(又称tp53)的n端，以防止这种内源性dna修复蛋白过早分解。复合fdsp-egcg与p53的n端的设计旨在阻断众所周知的p53与双微体2同源物(dm2)(也称为e3泛素-蛋白配体)之间的化学结合。这阻止了mdm2在其酪氨酸和色氨酸的氨基酸官能团残基上与p53的反式激活结构域结合。特别地，fdsp-egcg的芳香区被设计为能生成与色氨酸残基91号n端的中心对接位置键合的高效芳香π，以赋予p53蛋白最长的使用寿命。

18、在另一个方面，纳米颗粒集合体(ensemble)通过键合至c60，增强了egcg众所周知的抑菌作用，尤其是对于那些被称为“超级细菌”的细菌，因为它们已经进化出对处方抗生素的耐受性。

19、在一个相关方面，某些细菌通常生活在人们的皮肤上，但不会造成伤害。然而，如果这些细菌通过割伤、开放性伤口或其他皮肤破损处进入人体，则会引起皮肤感染或口腔感染。提供了一种明确的替代处方抗生素的方法，用于治疗由抗生素耐药细菌的病理菌株引起的口腔、皮肤或胃部感染。可被治疗的细菌类型的非限制性实例包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、导致“链球菌性咽喉炎”的“a”群链球菌(gas)或“链球菌”，以及尤其是脓疱病，因为它最常见于面部，表现为破裂的水泡，形成平坦、厚实、蜂蜜色(黄棕色)的结痂。

20、在另一个方面，提供了递送方法。在递送的一方面中，纳米气溶胶组合物在载体液体分配器中携带有fdsp-egcg，并且该组合物被汽化并递送至患者或使用者的鼻、口、气管和气道。

21、在递送的另一方面中，fdsp-egcg被吸附在沸石等矿物的孔隙结构上，用于口服施用并延时释放到肠道中，其中这些矿物的硅铝比的变化，或硅藻土矿的孔隙率的变化，或类似的负电荷矿物，提供了带电表面以及不同的孔隙尺寸，因此具有延时释放功能。

22、在递送的另一方面中，将fdsp-egcg配制成施用在皮肤和颊腔区域的局部乳霜载体。

23、在递送的另一方面中，将fdsp-egcg与甜味剂、风味剂和防腐剂一起配制成口服溶液，其适于制成饮料或用作现有饮料(例如传统的茶或咖啡)额添加剂。

24、本领域技术人员通过参考下述说明书、权利要求以及附图将进一步理解并领会本发明的这些以及其他优点。

25、参考相关附图详细描述一些实施方案。附加的实施方案、特征和/或优点将从随后的描述中变得显而易见或者可以通过实践本发明而获悉。在未按比例绘制的附图中，在整个描述中相同的标号指代相同的特征。下面的描述不应被视为限制性的，而是仅用于描述本发明的一般原理。