高分辨率空间转录组

本申请涉及用于产生具有高核糖核酸(rna)捕获效率的高分辨率空间转录组的系统、装置和方法。

背景技术：

1、组织中的细胞特异性基因表达的空间组织和动力学是理解解剖学、生理学和病理学的基础。原位捕获单独细胞的空间分辨组学数据对于理解如脑等异质组织的结构和功能是重要的。

2、在解离性单细胞rna测序(scrna-seq)之前(唐,f.c.(tang,f.c.)等人,自然方法(nat.methods)6,377-82(2009)；拉姆舍尔德(ramskold,d.)等人,自然生物技术(nat.biotechnol.)30,777-82(2012)；贾丁,d.a.(jaitin,d.a.)等人,科学(science)343,776-79(2014)；马克斯克,e.z.(macosko,e.z.)等人,细胞(cell)161,1202-1214(2015))，在形态学上完整的组织中实现全局性单细胞基因表达谱分析的技术将进一步揭示细胞组成的异质性、功能动力学以及对疾病和药物的应答。已经通过基于成像的原位rna杂交实现了空间分辨转录组谱分析(参见例如，e.卢贝克(e.lubeck)等人,自然方法9,743-48(2012)；k.h.陈(k.h.chen)等人,科学348,aaa6090(2015)；s.沙阿(s.shah)等人,神经元(neuron)92,42-357(2016))和测序(r.ke等人,自然方法10,857-60(2013)；j.h.李(j.h.lee)等人,科学343,1360-63(2014))。用于从组织切片获取空间转录物信息的当前技术依赖于任一种rna探针(例如，merfish(陈,k.h.(chen,k.h.)等人,科学348,aaa6090(2015))，seqfish(沙阿,s.(shah,s.)等人,神经元92,342-57(2016))，以及fisseq(李,j.h.(lee,j.h.)等人,科学343,1360-63(2014)))或空间条形码(例如，空间转录组(斯塔尔,p.l.(stahl,p.l.)等人,科学353,78-82(2016)；维奇科维奇,s.(vickovic,s.)等人,自然方法16,987-90(2019))，slide-seq(罗德里克,s.g.(rodriques,s.g.)等人,科学363,1463-67(2019)；斯迪克尔斯,r.r.(stickels,r.r.)等人,自然生物技术39,313-19(2021))以及dbit-seq(刘,y.(liu,y.)等人,细胞183,1665-81(2020)))。前者方法通常需要关于探针组调配物的先验知识；后者方法尚未实现接近解离性方法的单细胞分辨率和/或转录物捕获效率。

3、为了对单细胞转录组进行映射，两步法旨在进行解离性单细胞rna测序(scrna-seq)并且然后在组织背景下进行基于探针的细胞成像(莫菲特,j.r.(moffitt,j.r.)等人,科学362,aau5324(2018))。尽管已经在一些组织类型上得到验证，但是来自两种测定的数据是用不同样品收集的，并且罕见的细胞类型或功能状态往往在组织解离期间丢失。

4、空间条形码化rna测序技术已经通过增强转录物检测的分辨率和灵敏度而得到快速发展。先前的方法使用寡核苷酸阵列索引的(或空间条形码化)rna测序(p.l.斯塔尔(p.l.stahl)等人,科学353,78-82(2016)；s.g.罗德里克(s.g.rodriques)等人,科学363,1463-67(2019)；s.维奇科维奇(s.vickovic)等人,自然方法16,987-90(2019)；y.刘(y.liu)等人,细胞183,1665-81(2020))。此类方法采用具有空间分辨指数的阵列化寡核苷酸(例如，点样的(斯塔尔,p.l.等人,科学353,78-82(2016))、自组装的珠(维奇科维奇,s.等人,自然方法16,987-90(2019)；罗德里克,s.g.等人,科学363,1463-67(2019))和原位合成的(刘,y.等人,细胞183,1665-81(2020))阵列)作为引物，所述引物被掺入到源自置于阵列顶部的组织切片的原位合成的互补dna(cdna)中。对索引cdna的后续测序揭示转录物和其空间位置。在各种寡核苷酸阵列中，用聚合酶集落(称为“polony”(米特拉,r.d.(mitra,r.d.)和丘奇,g.m.(church,g.m.),核酸研究(nucleic acids res.)27,e34-e39(1999)；顾,l.(gu,l.)等人,自然(nature)30 515,554-57(2014))或“dna簇”(本特利,d.r.(bentley,d.r.)等人,自然456,53-59(2008)))和直径≤1μm的滚环集落(“rolony”或“dna纳米球”(德尔马纳茨,r.(drmanac,r.)等人,科学327,78-81(2010)))形成的阵列提供足够的分辨率来描绘细胞边界，以将所映射的转录物分离成单独细胞。最近，将在商业测序流动池中形成的此些阵列重新用于组织定位以证明改进的分辨率(陈,a.(chen,a.)等人纳米级分辨率的大视场-空间分辨转录组学(large field of view-spatially resolvedtranscriptomics at nanoscale resolution),在https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.01.17.427004v2(2021)上获得的预印本；乔,c.s.(cho,c.s.)等人,细胞184,3559-72(2021))。然而，所报告的数据主要聚集在常规仓中，并且特征分辨率不转换成单细胞分辨率。迄今为止，简单、稳健、不依赖于组织解离的scrna-seq尚未被证明可用于要求苛刻的应用，如脑定位。

技术实现思路

技术特征：

1.一种用于鉴定组织样品内的单细胞的位置和类型的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联的paa凝胶进一步包括1mg/ml至50mg/ml的n-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(brapa)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联的paa凝胶是在0℃至30℃的温度下和0％至60％的湿度下产生的。

4.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述polony凝胶包括：

5.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述polony图谱包括：

6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括：

7.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述cdna包括对所捕获的所述rna进行逆转录。

8.根据权利要求1所述的方法，其中鉴定所述细胞在所述polony凝胶上的位置包括：

9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

10.根据权利要求1所述的方法，所述组织样品包含包括所述细胞的细胞，所述方法进一步包括：

11.一种用于单细胞rna测序的polony凝胶，所述polony凝胶包括：

12.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述交联的水凝胶包括3％至20％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺、0.01％至1％的过硫酸铵以及0.01％至1％的n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)。

13.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述交联的水凝胶进一步包括1mg/ml至50mg/ml的n-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(brapa)。

14.根据权利要求13所述的polony凝胶，其进一步包括：

15.根据权利要求14所述的polony凝胶，其中所述引物包括硫代磷酸酯(ps)修饰和/或丙烯酰胺基修饰(acrydite modification)。

16.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一polony包括所述第一模板的100至1,000,000个拷贝，并且

17.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一捕获序列包括poly-t序列，并且

18.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一捕获序列与第一rna序列特异性结合，并且

19.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一捕获序列的长度为15至30个碱基，并且

20.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一捕获序列包括所述第一模板的3'端，并且

21.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一索引序列不同于所述第二索引序列。

22.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一索引序列的长度为10至50个碱基，并且

23.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一模板进一步包括第一测序引物，

24.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一polony的宽度为0.1μm至1μm，并且

25.根据权利要求11所述的polony凝胶，其中所述第一模板与所述第二模板之间的距离为0.1μm至1μm。

26.一种试剂盒，其包括：

27.一种产生polony凝胶的方法，所述方法包括：

28.根据权利要求27所述的方法，其中产生所述基础凝胶包括3％至20％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺、0.01％至1％的过硫酸铵以及0.01％至1％的n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)。

29.根据权利要求27所述的方法，其中将所述模板与所述基础凝胶连接包括：

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述捕获序列包括dna和/或蛋白质。

31.根据权利要求27所述的方法，其中暴露所述经扩增的模板的所述捕获序列包括：

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述酶包括taqi或xmai。

33.一种用于产生polony图谱的方法，所述方法包括：

34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括：

35.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括：

36.一种用于细胞分割的计算机实施方法，所述方法包括：

37.根据权利要求36所述的方法，其中基于所述polony图谱和所述测序数据产生所述网络包括：

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述网络的节点对应于所述mrna的所鉴定的所述序列。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述网络包括最近邻网络。

40.根据权利要求36所述的方法，其中鉴定所述细胞的所述边界包括将基于图形的检测和/或快速贪婪技术应用于所述网络。

41.一种系统，其包括：

42.一种非暂时性计算机可读媒体，其编码用于执行根据权利要求36所述的方法的指令。

43.一种用于产生空间转录组的方法，所述方法包括：

44.一种交联的聚丙烯酰胺(paa)凝胶，其包括：

45.根据权利要求44所述的交联的paa凝胶，其进一步包括：1mg/ml至50mg/ml的n-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(brapa)。

46.根据权利要求45所述的交联的paa凝胶，其中所述polony包括具有硫代磷酸酯(ps)修饰的引物。

47.根据权利要求44所述的交联的paa凝胶，其中所述polony包括具有丙烯酰胺基修饰的引物。

48.根据权利要求44所述的交联的paa凝胶，其中所述交联的paa凝胶是在0℃至30℃的温度下和0％至60％的湿度下聚合的。

49.根据权利要求44所述的交联的paa凝胶，其中所述polony包括：

50.根据权利要求44所述的交联的paa凝胶，其中所述polony包括：

51.根据权利要求44所述的交联的paa凝胶，其中所述polony包括：

52.根据权利要求44所述的交联的paa凝胶，其中所述polony中的单独polony的宽度大于或等于0.1微米且小于或等于10微米。

53.一种系统，其包括：

54.根据权利要求53所述的系统，其中所述图像进一步描绘安置在所述交联的paa凝胶上的组织样品的细胞。

55.根据权利要求53所述的系统，其进一步包括：

56.一种方法，其包括：

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述交联的paa凝胶包括3％至20％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1mg/ml至50mg/ml的n-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(brapa)、0.01％至1％的过硫酸铵以及0.01％至1％的n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)，并且

58.根据权利要求56所述的方法，其中所述交联的paa凝胶包括3％至20％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺、0.01％至1％的过硫酸铵以及0.01％至1％的temed，并且

59.根据权利要求56所述的方法，其中所述交联的paa凝胶是在0℃至30℃的温度下、0-60的湿度下产生的。

60.根据权利要求56所述的方法，其中将所述模板接种在所述交联的paa凝胶上包括将包括所述模板的溶液置于所述交联的paa凝胶的表面上。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述溶液包括1,000,000至1000,000,000,000种各包括空间索引的模板，所述空间索引包括长度为10至50个碱基对的独特dna序列。

62.根据权利要求56所述的方法，其中所述polony的宽度在0.1微米至10微米的范围内。

63.根据权利要求56所述的方法，其中在所述交联的paa凝胶的所述表面上产生所述polony包括：

64.根据权利要求56所述的方法，其中通过执行polony测序来鉴定所述polony的位置和边界包括：

65.根据权利要求56所述的方法，其中在所述交联的paa凝胶的所述表面上产生所述polony包括：

66.根据权利要求56所述的方法，其进一步包括：

技术总结
示例空间转录组学技术使用定制凝胶表面上的“连续”polony阵列进行空间条形码化。通过筛选聚丙烯酰胺(PAA)凝胶制造条件，显示了交联的PAA凝胶上所形成的polony表现出连续的、均匀的DNA分布，这高度适于组织条形码化应用。与广泛使用的在利用线性PAA凝胶的流动池中形成的polony相比，连续polony显示了高效的DNA扩增和限制性消化以产生空间RNA捕获性能显著更好的捕获寡核苷酸阵列。另外，所述交联的PAA凝胶显示了对侧向RNA扩散的足够限制并且为组织定位测定提供比通过先前方法使用的半流体线性PAA凝胶更好的机械强度和稳定性。

技术研发人员：古良才,付晓楠,S·林,孙立
受保护的技术使用者：华盛顿大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1